Dicer和Drosha在内皮细胞Mic

摘要

MicroRNA(mirna)是一类小的非编码RNA，通过与细胞转录物结合来调节基因表达，从而导致翻译抑制或靶mRNA降解。Dicer和Drosha是miRNA成熟所需的miRNA加工酶。在此，本文研究了Dicer和Drosha在血管生成中的作用。用siRNA转染内皮细胞对抗Dicer和Drosha，以抑制miRNA的生物合成。Dicer和Drosha的遗传沉默显著降低了内皮细胞的毛细血管萌发和成管活性。在DicersiRNA转染的细胞中，内皮细胞的迁移显著减少，而DroshasiRNA没有影响。Dicer(而非Drosha)沉默会降低体内血管生成。接下来，又尝试鉴定在内皮细胞中表达的miRNAs。使用实时PCR对种人miRNAs进行的筛选分析显示，let-7家族成员mir-21、mir-、mir-和mir-在内皮细胞中高度表达。Dicer和DroshasiRNA降低了lef-7f和mir-27b的表达。针对let-7f和mir-27b的抑制剂也减少了芽的形成，表明let-7f和mir-27b通过靶向抗血管生成基因促进血管生成。对let-7簇的预测靶的计算机分析鉴定了内源性血管生成抑制剂血小板反应蛋白-1.实际上，Dicer和DroshasiRNA显著增加了血小板反应蛋白-1的表达。总之，miRNA调节酶Dicer的瞬时减少会损害体外和体内血管生成，而DroshasiRNA在体外诱导了轻微的抗血管生成作用，但在体内无效。let-7家族和mir-27b似乎是调节血管生成的有吸引力的靶点。

研究背景

MicroRNAs(miRNAs)是一类新型的高度保守的非编码小RNA，通过与转录本结合，在转录后水平上调控基因表达，导致靶mRNA的翻译抑制或降解。越来越多的证据表明，miRNAs参与了各种生物过程，如心脏发生、骨骼肌增殖和分化、大脑形态发生、肿瘤发生和造血谱系分化。

miRNAs是由两种主要酶Dicer和Drosha介导的两步处理途径中产生的，它们属于RNAseIII内切酶类。虽然Drosha在体内的功能目前尚不清楚，但Dicer在脊椎动物的发育中起着至关重要的作用。双基因缺陷小鼠在胚胎发育早期死亡，在胚胎第12.5-14.5天之间，显示血管和卵黄囊形成受损。斑马鱼Dicer突变胚胎在原肠形成、大脑形成、体细胞发生和心脏发育过程中表现出异常的形态发生。最近的一项研究表明，mir-和mir-调节人脐静脉内皮细胞的血管生成特性(HUVECs)。然而，miRNAs在内皮细胞生物学中的功能尚不清楚。因此，本文主要研究mirna调节酶Dicer和Drosha在内皮细胞血管生成功能中的作用。研究结果表明，Dicer和Drosha在体外是内皮芽和网络形成的关键调控因子，而只有DicersiRNA在体内显著阻断了血管生成。

方法与结果

首先使用免疫细胞化学和Westernblot分析评估了这两种酶的表达和定位。Dicer主要定位于细胞质，而Drosha的定位仅限于内皮细胞核(图1A和1B)。siRNA法测定Dicer和Drosha表达沉默后的内皮发芽和网络形成(图1C和1D)。Westernblotting证实各自的siRNA寡核苷酸对Dicer和Drosha的有效和特异性抑制(图1D)。Dicer和Drosha的减少显著抑制了基础和碱性成纤维细胞生长因子刺激的内皮细胞芽形成(图2A和2B)，而VEGF诱导的芽形成被DicersiRNA选择性阻断(在线数据补充资料中的图I，可查阅

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