基于斑马鱼模式生物的西洋参皂苷类成分增强

摘要：目的研究西洋参皂苷类成分增强免疫作用及其作用机制。方法通过耐受性考察及免疫低下模型确定西洋参皂苷类成分提取物的给药剂量以及雷帕霉素的最优造模剂量后，将受精后48h（48hpf）的斑马鱼分为对照组（0.5%二甲基亚砜）、模型组（4μg/mL雷帕霉素）和3个产地（中国山东、中国吉林、加拿大）不同质量浓度的西洋参组（4μg/mL雷帕霉素＋10、25、50μg/mL西洋参皂苷类成分提取物）；孵育一定时间后，以斑马鱼尾部中性粒细胞数目、巨噬细胞吞噬功能及体内γ干扰素（IFN-γ）含量为指标，计算中性粒细胞增长率，考察西洋参皂苷类成分提取物的增强免疫作用。结果西洋参皂苷类成分提取物给药质量浓度高于50μg/mL时，幼鱼死亡率随给药质量浓度的增大及给药时间的延长逐渐升高；与对照组相比，模型组斑马鱼尾部中性粒细胞数目显著减少（P＜0.01），体内IFN-γ含量显著减少（P＜0.01）；与模型组相比，10、25μg/mL西洋参组斑马鱼尾部中性粒细胞数目显著增加（P＜0.01），吞噬墨水颗粒的巨噬细胞数目显著增加（P＜0.01），体内IFN-γ含量显著增加（P＜0.01）；中性粒细胞增长率在19.73%～96.49%。结论西洋参皂苷类成分具有较好的增强机体免疫功能作用。

西洋参PanaxquinquefoliumL.味甘、微苦，性凉，归心、肺、肾经，可补气养阴，常用于治疗气虚阴亏等[1]，具有增强机体免疫力、抗疲劳等多种生理活性[2-3]，但其质量控制方式仍是亟需解决的难点问题[4-6]。已有实验研究表明[7-9]，西洋参可提高刀豆蛋白A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力、小鼠血清溶血素抗体水平，增加小鼠溶血空斑数，提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率。但是采用小鼠为动物模型进行免疫功能研究具有造模时间长、操作复杂、重复性差，不适宜进行高通量药材药效活性筛选的缺点。

斑马鱼（Daniorerio，zebrafish）是国际认可的新型模式生物，具有体型小，发育周期全透明、繁殖周期短、产卵量大、发育迅速等优点[10-11]。本研究采用斑马鱼制备免疫低下模型[12-13]，以中性粒细胞数目、巨噬细胞吞噬功能及γ干扰素（IFN-γ）的含量为考察指标研究西洋参的增强免疫作用，为免疫功能的研究提供良好的建模方法及指标选择思路，同时为高通量筛选西洋参增强免疫功能药效指标及谱-效相关质量评价系统[14]的建立提供良好的技术支撑。

1材料

1.1仪器

SPX-B-G光照培养箱，上海基星生物科技有限公司；AGBPS电子天平，德国Sartorius公司；Milli-QIQ纯水机，美国MILLIPORE公司；KDM-A控温电热套，金坛市医疗仪器厂；SW-CJ-1FD净化工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；HWS智能型恒温恒湿培养箱，宁波江南仪器厂；GZX-MBE电热鼓风干燥箱，上海博讯仪器厂；GI54DWS高压灭菌机，南京庚辰科学仪器有限公司；BIORADxMark酶标仪，美国Bio-Rad公司；KQDV超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；AXIOZoom.V16体式荧光显微镜，德国ZEISS公司；PCO-显微注射仪，力钧生物科技有限公司。

1.2试剂与试药

二甲基亚砜（DMSO），上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析纯，批号；雷帕霉素（批号E）、印度墨水（批号N）、中性红（批号C），北京索莱宝科技有限公司；IFN-γ酶联免疫试剂盒（批号C）购自武汉华美生物工程有限公司。

1.3模型动物

AB系及Tg（lyz：EGFP）转基因斑马鱼，由山东省科学院生物所提供。

2方法

2.1样品的收集及处理

西洋参饮片3批（中国山东，批号；中国吉林，批号；加拿大，批号；均为散购或大田直接收购药材，经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定均为五加科人参属植物西洋参PanaxquinquefoliumL.的干燥根。3批西洋参饮片中人参皂苷Rg1、Re、Rb1总皂苷含量均符合《中国药典》年版一部规定[1]，总皂苷质量分数分别为2.98%、3.50%、4.22%）粉碎过三号筛，各取1g，分别置于圆底烧瓶中，加入70%乙醇50mL，称定质量，加热回流提取2h，放冷，补足减失的质量，摇匀滤过。取续滤液25mL蒸干，干燥物分别以DMSO溶解，制备成mg/mL的西洋参提取物母液。

2.2斑马鱼的培养及胚胎收集

斑马鱼成鱼明暗交替、品系及雌雄分开、恒温恒湿饲养，每日饲喂丰年虾。按照实验需要选取同品系斑马鱼按照雌雄比例1∶1或1∶2放置于产卵缸，采用隔板将雌雄斑马鱼隔开，次日光照前抽离隔板，使其自由受精，于抽离隔板时计时为0hpf（hourspostfertilization，受精后时间），抽离隔板后2h收集受精卵，置于清洁培养液中滴加适量亚甲基蓝溶液，28℃恒温光照继续培养。

2.3西洋参提取物耐受性考察

选用48hpf的AB系斑马鱼受精卵，经过脱膜处理（链蛋白酶，1mg/mL），显微镜下筛选发育正常的幼鱼，每孔10条，每组平行2孔；设置加药组：西洋参提取物终质量浓度分别为10、50、、、、μg/mL，DMSO体积分数极值为0.5%，同时设对照组：DMSO体积分数为0.5%。加盖置于28℃恒温光照培养箱中孵育，每隔24h更换药液，记录给药后24、48、72h时斑马鱼死亡情况。

2.4雷帕霉素对斑马鱼免疫功能的影响

选用48hpf的Tg（lyz：EGFP）转基因斑马鱼，脱膜后在荧光显微镜下筛选中性粒细胞荧光标记正常的幼鱼，每孔10条，每组平行2孔；设置分组使雷帕霉素终质量浓度为2、4、8μg/mL，同时对照组的DMSO体积分数为0.5%，加盖置于28℃恒温光照培养箱中孵育24h，采用荧光显微镜对斑马鱼尾部中性粒细胞拍照并计数，采用SPSS统计软件进行One-wayANOVA分析。

2.5西洋参对中性粒细胞数目的影响

按照“2.4”项下方法，另设西洋参组给予不同批次西洋参提取物，模型组及西洋参组雷帕霉素终质量浓度为4μg/mL，西洋参组西洋参提取物终质量浓度分别为10、25、50μg/mL，对照组的DMSO体积分数为0.5%。加盖置于28℃恒温光照培养箱中孵育24h，采用荧光显微镜对斑马鱼尾部中性粒细胞拍照并计数，采用SPSS23.0统计软件进行One-wayANOVA分析。

2.6西洋参对巨噬细胞吞噬功能的影响

选用48hpf的AB系斑马鱼（为减少黑色素对计数的影响，6hpf时加入苯硫脲）脱膜并筛选正常幼鱼，麻醉后在其卵黄囊内注射微量的印度墨水。按照“2.5”项下分为模型组及西洋参组，未注射印度墨水的斑马鱼作为对照组。加药后置于28℃恒温光照培养箱中，每天更换药液并清除死亡斑马鱼，72h后采用中性红（1.25μg/mL）染色3h，结束后清洗幼鱼，采用显微镜观察并统计吞噬了墨水颗粒的巨噬细胞数量，并采用SPSS23.0统计软件进行One-wayANOVA分析。

2.7西洋参对斑马鱼体内IFN-γ含量的影响

选用48hpf的AB系斑马鱼经过脱膜处理，每孔30条，每组平行2孔；使模型组及西洋参组雷帕霉素终质量浓度为4μg/mL，西洋参组西洋参提取液终质量浓度为10μg/mL，另使对照组的DMSO体积分数为0.5%。共同作用24h后各组斑马鱼分别用1倍量PBS清洗，以每管60条收集于EP管中，并按照每mg样本加入缓冲液1mL的原则加入相应体积的PBS，匀浆后离心（4℃，r/min，5min）取上清液，采用酶联免疫反应法检测样本中IFN-γ的含量，采用SPSS23.0统计软件进行One-wayANOVA分析。

3结果

3.1西洋参提取物耐受性

由图1可知，给药后72h内，当给药质量浓度高于50μg/mL时，随着给药质量浓度的增大，幼鱼死亡率显著升高；同时随着给药时间的延长，死亡率也逐渐升高。

3.2雷帕霉素对斑马鱼免疫功能的影响

由统计结果（表1和图2）可知，雷帕霉素导致斑马鱼免疫力下降，表现为与对照组相比，雷帕霉素组斑马鱼中性粒细胞数目极显著减少；同时，随着雷帕霉素质量浓度增加，中性粒细胞数目减少明显，免疫抑制作用呈现剂量依赖性。

3.3西洋参对中性粒细胞数目的影响

由统计结果可知（表2和图3），与对照组相比，模型组斑马鱼尾部中性粒细胞数目显著减少，说明雷帕霉素造成了斑马鱼免疫抑制。与模型组相比，3批西洋参提取物低、中浓度组均可显著增加中性粒细胞数目，说明西洋参具有抗雷帕霉素引起的免疫力低下作用。同时，在一定质量浓度范围内随给药质量浓度的增加，增强免疫力作用增强；当给药量为50μg/mL时，增强免疫力作用减弱，甚至表现出免疫抑制作用。另外，与中、低质量浓度的吉林产西洋参相比，山东及加拿大产西洋参促中性粒细胞数目增长作用明显，且具有显著差异，说明不同产地的西洋参增强免疫力作用不同。

增长率＝(给药组中性粒细胞数目－模型组中性粒细胞数目)/(空白对照组中性粒细胞数目－模型组中性粒细胞数目)

3.4西洋参对巨噬细胞吞噬功能的影响

由统计结果可知（表3），西洋参可以提高巨噬细胞吞噬能力，表现为西洋参组斑马鱼吞噬了印度墨水的巨噬细胞数目较模型组显著增加，与中性粒细胞数目统计结果相似。

3.5西洋参对斑马鱼体内IFN-γ含量的影响

由统计结果可知（图4），雷帕霉素可导致斑马鱼体内的IFN-γ含量显著降低；3批西洋参组均可以提高斑马鱼体内的IFN-γ含量；与吉林产西洋参相比，山东及加拿大产西洋参提高斑马鱼体内的IFN-γ含量作用较好，且具有显著差异；与中性粒细胞数目、巨噬细胞吞噬功能统计结果一致。

4讨论

本研究选用雷帕霉素免疫抑制剂建立斑马鱼免疫力低下模型，结果显示2、4、8μg/mL的雷帕霉素均可导致斑马鱼中性粒细胞数目显著下降，选用4μg/mL作为造模质量浓度，此时中性粒细胞的抑制率为43%。

根据文献报道[2,15]及前期实验中对西洋参皂苷类成分UPLC-Q-TOF-MS/MS指纹图谱的研究，采用70%乙醇提取西洋参中皂苷类成分，并对其中人参皂苷Rg1、Re、Rd、Rc、Ro及拟人参皂苷F11等17种皂苷类成分进行了定性、定量分析[16]。

通过耐受性实验确定了西洋参皂苷类提取物最高给药质量浓度为50μg/mL；通过统计中性粒细胞数目及巨噬细胞吞噬能力，确定了西洋参皂苷类提取物质量浓度为10、25μg/mL时，表现为增强免疫作用，同时随着质量浓度升高，作用越好，当质量浓度高于50μg/mL时，增强免疫作用减弱。

综合考虑药效指标及凸显不同产地西洋参的药效差异，选择10μg/mL作为西洋参增强免疫药效考察的给药剂量。

IFN-γ为II型干扰素[17]，由活化T细胞、NK细胞产生，可以激活巨噬细胞，诱导Th1细胞分化并抑制Th2细胞分化，增强机体免疫能力[18-20]。雷帕霉素造成斑马鱼自身免疫系统损伤，导致IFN-γ分泌减少；西洋参给药后可以促进IFN-γ的分泌，进而促进斑马鱼的免疫功能恢复正常。

本研究建立的斑马鱼免疫功能评价模型具有造模周期短、检测指标科学合理、客观、灵敏易测的优点。西洋参皂苷类成分具有增强机体免疫力作用，表现为可以增加斑马鱼中性粒细胞数量、改善巨噬细胞吞噬功能及促进体内IFN-γ的分泌；其中，各产地中、低浓度西洋参皂苷类成分提取物较高浓度组均具有较好的增强免疫力作用。

另外，本研究建立的模型及选用的检测指标可以很好地反映不同产地西洋参间的药效差异：中国山东及加拿大产西洋参，较中国吉林产西洋参增强免疫力作用较好，本实验为西洋参增强免疫力高通量药效指标筛选提供了良好的实验方法，同时为西洋参谱-效相关质量评价系统的建立提供了科学的数据支撑。

参考文献（略）

来源：吕婧，高燕，李晨，杨龙飞，赵渤．基于斑马鱼模式生物的西洋参皂苷类成分增强免疫作用研究[J].中草药,,51(14):-.