徕卡共聚焦课堂第一讲针孔几何形状完美的四

共聚焦成像的光学切片要求在光路发射部分的场共轭平面上有一个小孔。在最简单的情况下，这个孔径为圆形，允许透射出照亮孔径的艾里衍射图案的中心部分。孔径大小应该刚好可以通过该图案（“艾里斑”）的内圈。因此，孔径的正确大小取决于波长和物镜的数值孔径，因为这些参数也定义了中间像平面中的（放大）衍射图案。为了适应不同的颜色和分辨率，检测针孔应该可变。要获得精确的圆形孔径，这意味着在机械设备上提供一组孔径，以便在需要时可以改变大小。大多数共聚焦显微镜使用一种可调谐针孔代替，通常为双叶片“虹膜”。因此，孔径不是圆形，而是矩形（正方形）。有人认为，六角形针孔（使用三枚叶片）在传递焦点信息方面会更有效，因为它可以覆盖较大部分的圆形[1,2]。不同几何形状的面积可以通过孔径的光量显然取决于孔径本身的大小。举例来说，对于圆形孔径，如果半径增加，就会透射更多光线。然后，该透光量取决于由半径r定义的面积Ac：

如果孔径为方形，则面积As的计算取决于边长a：

最后，通过边长s给出六边形的面积Ah：

所有这些计算只需具备中学知识即可。然而，如何比较不同尺寸并无明确规定：例如，你可以比较内接于圆形的六边形。这种情况下，这些面积的比率为Ac：Ah：As=：83：64。正方形的面积比六边形小大约30%。这一结果被用来证明使用六边形孔径时，与正方形光圈相比，“亮度提高了30%”。这一声明来自官方，甚至出现在公开网站上。同样的，人们可以使用带内接圆形的多边形比较。这种情况，这些面积的比率为Ac：Ah：As=：：，由此我们可以得出结论，使用方形孔径时，亮度可以提高大约15%。很明显，这两种论述在科学上都站不住脚，会让读者陷入迷惑，当然这可能就是这种陈述的目的。由于通过孔径的光量取决于面积，因此比较不同尺寸的正确参数是各种几何形状的面积。通过非常简单的数据运算，你可以知道：

必须要获得面积与半径为r的圆形孔径相同的多边形。这一共识在年代末就被共聚焦社区所认同（因为这是唯一明智的做法）。因此，如果正确比较，不同几何形状的孔径将传输相同的光量，并且光线分布均匀。

图1：用于比较不同几何形状孔径的选项左：内接于圆的多边形。多边形的角越多，面积就越大。右：内接于多边形的圆多边形的角越多，面积就越小。正确的方法显示在中间：计算多边形的边长，使多边形面积与圆面积相同。针孔卷积与PSF事实上，投射到针孔的光强分布并不均匀，而是由艾里衍射图案确定。为了找出实际的透光效率，必须将不同几何形状和大小孔径同艾里图案叠加在一起。例如，圆形和方形针孔需要进行此等操作，其中的独立参数是长度vd，该长度vd默认根据圆形半径调整，以便产生相同的面积[3]我们计算了艾里图案通过各种几何形状和大小的孔径时的光量，以研究其与面积本身的函数关系，这样更易理解并能进行适当的比较。最简单的情况是与圆形孔径的依赖关系，它能够整合进来的（固定的）艾里图案的强度分布：

以计算多边形孔径的强度分布，并用数值方法进行叠加。图2清晰表明，至少对于圆形和等边多边形，焦距强度与几何形状完全无关。差异在大约2%的范围内变化，六边形分布在圆形和正方形之间，与预期相同。因此，关于检测针孔形状的焦平面信号传输效率（在（1）中称为“亮度”）的任何结论均没有任何意义。如果存在差异，则说明比较参数选择错误。

图2：通过不同形状和大小的孔径传输信号的比较。目前使用的几何形状包括圆形、方形和六边形。当用艾里图案计算照明时，所有几何形状都显示出几乎相同的对大小的依赖关系，而该大小由孔径面积决定。光谱共聚焦中的针孔几何形状如上所示，正多边形的边数对聚焦信号的传输没有影响。没有理由假设对散焦信号也是如此。因此，看起来圆形、方形和六边形针孔在性能上相同。对于基于滤光片的经典共聚焦显微镜来说，这可能是一个合理的结论。用于使用色散元件作为不同发射带的分离器件的共聚焦显微镜时，存在差异。对于含有色散元件的装置，其光谱分辨率不仅取决于元件本身的性能，还取决于入射光束的尺寸和几何形状。显然，较大的光束直径会降低光谱分辨率。我们把记录光谱的中间像平面（光度计滑块的位置等）称为光谱平面。较大的物体会在光谱平面上造成较大的图像。在光谱平面中的任何给定位置，若物体尺寸较大，更多的颜色将有助于局部强度。因此，光谱探测的一个固有结果是光谱分辨率依赖于针孔大小，因为针孔在光谱平面上成像！因此，光谱平面中图像的几何形状是针孔（放大后）的衍射图样。这些衍射图案的差别很大，取决于几何形状。圆形孔径会引起众所周知的艾里图案，它旋转对称。针孔在光谱平面中旋转不会引起差异。正方形的衍射图样并非旋转对称，其特征是在边缘有强烈的波瓣，而强度会由内向外大幅下降。这种效应用来提高共聚焦扫描显微镜的光谱分辨率[4]：当针孔在光谱平面内旋转45°时，中心盘外的大部分光强会被引离探测范围。光谱平面上的颜色重叠就会大幅减少——在本例中减少了1.5倍。在使用六边形针孔的系统中，这种影响要小得多，增益可以忽略不计。因此，最佳的光谱共聚焦装置采用一个正确定向的方形针孔。

图3：利用相对于色散方向旋转45°的正方形针孔绘制光路设计图。这种组合优化了固有的光谱分辨率——任何其他几何形状都会损害光谱性能。相关链接：荧光、活细胞成像、类器官和3D细胞培养、超高分辨率显微镜和纳米显微镜、癌症研究、细胞生物学研究、荧光寿命成像、模式生物研究、光操作、病毒学、斑马鱼研究

转载请注明：http://www.abuoumao.com/hyfw/6427.html