基因组结构决定了硬骨鱼的早期多样化
准确的物种系统发育是所有进化研究的先决条件。真骨类是现存脊椎动物中规模最大、种类最多的一类，但它们三个最古老的谱系之间的关系仍未解决。在七个高质量的新基因组组装的基础上，我们使用独立的基因序列和染色体重排系统发生学方法重新审视了硬骨鱼系统发生学最深分支的拓扑结构。这些分析汇聚到一个单一的场景中，该场景明确地将长鼻鱼和骨舌鱼（arapaima，象鼻鱼）与所有其他硬骨鱼（即斑马鱼、青鳉）作为单系姐妹群。这一发现解决了50多年来关于这些谱系进化关系的争论，并突出了结合不同水平的全基因组信息来解决复杂的系统发育问题的能力。
物种系统发育追溯了现存物种之间的进化关系（1）。准确的物种树对于我们理解和描述地球上生命的进化很重要，但它们也是在发育、解剖、遗传和物种层面进行进化分析的基本前提。
硬骨鱼有3万多种，约占现存脊椎动物的一半（2）。它们的系统发育在不同的分类层次上一直存在许多争议（2，3）。在这些争论中，一个长期存在且尚未解决的重大问题涉及冠硬骨鱼最早分支分支的拓扑结构，该分支分支在约2.5亿年前（Myr）就已经分化（4，5）。这些最早的皇冠硬骨鱼分支分支是长舌鱼（Elopomorpha）（包括塔蓬鱼、骨鱼和鳗鱼）、骨舌鱼（以“骨舌”命名，包括金眼鱼、arapaima和象鼻鱼），以及Clupeocephala谱系中所有现存的硬骨鱼（包括，例如，斑马鱼，一种生物医学研究的模式生物）（3，6）。
由于它们的解剖和形态特征，近年前（7）首次被认为是最“原始的活硬骨鱼”。从那时起，长骨形目和骨舌形目被作为硬骨鱼最早的分支分支。年提出的第一个场景（8）将骨舌单形目作为长头目的姐妹群，长头目由长头目和短头目组成（图1A）。后来在年（9，10），这种情况受到了挑战，因为将Elopomorpha作为硬
随着20世纪90年代分子系统发育方法的出现，使用基因序列系统发育重建对这个问题进行了广泛的重新探讨[在（3，11）中回顾]。然而，尽管进行了广泛的努力，包括几个大规模的多焦点方法（4、5、12），但尚未达成一致意见支持长隆头畸形或骨舌头畸形假说。此外，第三种拓扑结构，将Elopomorpha和Osteoglosomorpha作为姐妹群（图1C），在20世纪90年代初被提出（13），此后得到了一些最新研究的支持（4，14–19）。这个分支，我们暂时命名为Eloposteolosocephala（图1C），没有被正式保留，可能是因为这种拓扑结构没有得到任何形态学证据的支持（3）。最近对基因序列系统发育研究的重新分析证实了盛行的假说（11），因此仍然是骨舌头鱼假说，该假说将Elopomorpha作为现存硬骨鱼的最早分支分支（5）。然而，这些主要硬骨鱼谱系的精确系统发育关系仍然存在争议，最近Dornburg和Near（3）对其进行了审查，认为这是21世纪关于放线鳍鱼纲鱼类进化的主要未解决问题之一。为了促进对这一问题的重新审视，他们建议保留“骨舌形态和elopomorph姐妹群关系的非常规和有趣的可能性”（3）。
系统发育分析的多尺度基因组方法
为了解决这些早期分支硬骨鱼分支的系统发育关系，我们首先对7个物种的高质量参考基因组序列进行了测序、组装和注释，这些物种代表了主要的Elopomorpha目或家族（图2和表S1），其中缺少染色体水平的全基因组资源。我们将这七种长臂猿的基因组信息与另外18种公开可用的基因组组合结合起来，包括四种骨舌单形目、十种头状目和四种脊椎动物外类群，包括斑角鱼和无尾弓鳍鱼，以进行系统发育分析。
图2。具有代表性的Elopomorpha物种的系统发育示意图。
（A）该树拓扑基于（29），包括我们为其提供新的全基因组组装的每个物种。（B）这七个基因组中的六个以高质量基因组组装度量在染色体规模（Chr）上组装。基因组大小；N.Chr，单倍体染色体数；N.Co，重叠群数量；N50，基因组组合的一半被较长序列覆盖的序列长度；L50，所需支架的最小数量达到预测基因组大小的一半。
实现硬骨鱼基因的精确系统发育分析的一个主要挑战是它们的大量重复（旁系）基因拷贝。这些旁系中的许多都是从一个全基因组复制（WGD）中遗传而来的，该复制发生在最后一个共同祖先中，在现存硬骨鱼谱系多样化之前的50至70百万（20）。已知这些WGD旁系会误导系统发育重建（4）。为了减轻并列包含的影响，我们应用了一个WGD定制的流水线，利用基因序列和同源性保护（21），在我们分析的所有25个基因组中选择个高置信度1对1同源基因。该列表代表了迄今为止硬骨鱼系统发育重建所考虑的最大的分子数据集，无论是从取样的Elopomorpha基因组还是总比对大小来看（图S1）。然后，我们在这个单独基因树的基础上进行了系统发育重建，使用ASTRAL[精确物种树算法（图3A；图S2用于蛋白质树）]进行了基于合并的总结分析，并在核苷酸和蛋白质水平上对其连接序列进行了最大似然分析（图S3和S4）。这些分析都为长后异舌目动物假说提供了支持，该假说将骨舌目动物和长舌目动物作为姐妹群。此外，基因谱系询问进一步支持了这一Eloposteolosocephala分支，该询问基于单个基因序列比对直接比较了三种进化场景中每一种的可能性（图3B）。这些结果对我们使用的标记选择方法是稳健的（图S5和表S2）。
图3。不同的系统发育重建方法汇聚在一起，支持骨舌形态和长柄形态作为姐妹群体。
（A）在个单拷贝基因树的多光谱合并模型（30）下，利用ASTRAL推断出物种树。该方法测量聚结单元中的内部分支长度；终端分支处的长度表示为相等和任意的。节点支持被计算为局部后验概率。（B）分子基因谱系询问：支持每个假设的基因树数量（顶部，灰色条），显著支持每个假设（顶部，黑色条），以及显著拒绝的基因树的数量（底部，虚线条）。（C）从个标记基因之间的基因邻接估计相邻物种树。分支长度表示断开邻接的比例，节点由引导值支持。（D）基于共享同基因断点的最佳支持物种树，使用PhyChro（基于部分分裂距离的系统发育学方法）重建（21，23）。分支长度是断点数量的估计值。分支分数对应于支持分支的信息断点的分数。注意，分支分数不同于引导分数（21）。（A至D）为了可视化目的，用虚线延长了非常短的分支。实线报告真实分支长度。
然而，由于先前基于序列的研究得出了相反的结果来解决三个早期分歧的硬骨鱼分支（4，11），我们还使用了两种创新的全基因组方法来基于基因组结构的保护推断物种树。首先，我们分析了个同源标记基因之间的基因相邻性保护，覆盖了每个硬骨鱼基因组的57%至98%，并从局部微同步保护中推断出一个相邻的物种树（22）。第二，我们还通过测量PhyChro（23）物种之间的共享染色体断点的比例，基于一组独立的、大规模的SynChro（24）同源标记，分析了宏观同步进化。这两种互补的方法（图3，C和D；图S6；和表S2）也为长后异舌头畸形的情况提供了一致的支持，证实了基因序列系统发育的结果。
此外，通过观察所有潜在的染色体大重排，我们鉴定了骨舌形态和长柄形态物种的核型之间唯一共享的单个染色体融合（图4和图S7至S9）。再加上没有与其他类群相一致的其他重排，这种相同的染色体大重排进一步支持了我们的发现，表明这两个类群来自共同的祖先，加强了长后异舌头类分支的系统发育学证据。
图4。染色体重排在Eloposteolosocephala分支内共享。
硬骨鱼中两对重复染色体（1a-1b和2a-2b）的推测重排情况。Osteglossomorpha和Elopomorpha共享1a-2a染色体融合，而Clupeocephala经历了1b和2b之间的独立融合（基于基因树的场景支持见图S7，所有研究基因组的结果见图S8，也支持Elopomorphia和Osteoglosomorpha单系的替代祖先场景讨论见图S9）。
利用新的长臂猿全基因组资源和一系列独立的系统发育重建方法，我们解决了有关硬骨鱼早期进化的长期问题。这一成就突出了全基因组方法在解决复杂和古老的进化史方面的威力，特别是当这些方法将各种信息丰富的进化特征与序列信息相结合时。特别是染色体重排以较低的速率固定，因此不易发生突变饱和和性格逆转，这可能发生在基于序列的系统发育中（25）。
长后异舌头龙是一个新的意外分支
我们的研究结果解决了50多年来的争议，并表明，长舌龙属和骨舌龙属构成了一个单系支，因此我们建议将其命名为长舌舌龙属（Elopostheoglosocephala）（21）。尽管经过了70多年的广泛研究，但这一结论引发了对支持这一方案的解剖学证据不足的质疑（3，6）。根据我们的研究结果，我们仔细检查了关于这些解剖特征的现有文献，我们无法找到一种独特且明确的形态特征，这两种形态特征都是由长隆畸形和骨舌畸形共同拥有的。然而，关节后与角关节和/或关节的融合，这是一种先前被认为是骨舌形态突触的衍生特征（26，27），已表明至少与骨舌形态中的mormyrids（27，28）共享。即使这种特征在金眼海龙阿洛索虫中被描述为存在（28）或不明确，而在其他两种骨舌形态中不存在（27），我们认为这种衍生状态是长后异舌头的形态突触形态，而在一些骨舌形态动物中，这种形态突触形态被第二次丢失。我们预计，作为我们的发现的结果，更多的字符映射和新的有针对性的解剖和形态学搜索将很快提供由长后异舌头动物共享的无歧义的突触。
通过解决冠硬骨鱼三个最早分支分支分支的关系，我们的结果突出了组合不同水平的全基因组信息来解决复杂系统发育的能力。这种早期硬骨鱼多样化的精确拓扑将作为对其基因组和功能进化进行新研究的基础。
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