超声波对红枣多糖的提取
1.提取顺序
1.1红枣去核切片→干燥粉碎、过40目筛→超声提取红枣多糖→离心取上清液→加入4倍体积无水乙醇醇沉过夜→离心取沉淀定容→苯酚硫酸法测多糖含量
以1.0g枣粉为基准,固定提取温度60℃,超声时间30min,超声功率W,研究不同液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL∶g)对红枣多糖提取率的影响;固定液料比20∶1(mL∶g),超声时间30min,超声功率W,研究不同提取温度40、50、60、70、80℃对红枣多糖提取率的影响;固定液料比20∶1(mL∶g),提取温度60℃,超声功率W,研究不同超声时间10、20、30、40、50min对红枣多糖提取率的影响;固定液料比20∶1(mL∶g)、提取温度60℃、超声时间30min,研究不同超声功率、、、、W对红枣多糖提取率的影响。1.3.1.2响应面优化设计在单因素试验的基础上,固定超声功率W,确定超声温度、液料比以及超声时间的3因素3水平。利用Design-Expert8.0.6软Box-Behnken法设计优化试验,以多糖提取率为响应值,研究提取红枣多糖的最优工艺参数。响应面水平如表1所示。
表1响应面试验因素水平表
表1反应面实验的影响因素及水平1.2红枣多糖分离纯化
将最优条件得到的多糖样品进行石油醚脱脂,用石油醚和粗多糖溶液按1:1体积比充分混匀,用分液漏斗分离,重复3次脱脂;Sevage法脱蛋白;通过透析去除小分子杂质,浓缩后冷冻干燥多糖组分,用于后续实验。
1.3.指标测定
采用苯酚硫酸法测定红枣多糖含量,回归方程为:y=0.x+0.,R2=0.。采用考马斯亮蓝法对红枣多糖蛋白质含量进行测定,回归方程为:y=8.x+0.,R2=0.。
1.4.单糖组成
在80℃下,10mg多糖用4mL2.0mol/L的三氟乙酸(trifluoroaceticacid,TFA)水解6h,通过N2冲洗除去溶液中残留的TFA,然后溶于10mL超纯水中并通过SPE管和0.22μm超滤管进行澄清。
2.光谱分析
2.1紫外光谱分析将多糖溶液在~nm波段下进行扫描,分析扫描图谱,观察有无核酸吸收峰(nm)和蛋白质吸收峰(nm),检测杂质是否去除干净。
2.2红外光谱分析
取适量干燥的多糖样品使用傅立叶红外光谱分析(Fouriertransforminfraredspectroscopy,FT-IR)在0~cm-1范围内扫描,使用OMNIC软件分析结果。
2.3.刚果红染色取1mL1mg/mL红枣多糖溶液、2mL60μmol/L刚果红溶液及1mL不同浓度的NaOH溶液,静置15min后观察不同浓度的NaOH溶液中多糖最大吸收波长的迁移情况。
3.抗氧化
3.1.体外抗氧化总还原力的测定,参照LIN等的方法;DPPH自由基清除能力测定,参照许海顺等的方法;ABTS阳离子自由基清除能力的测定,参照胡治远等的方法。
3.2斑马鱼模型的抗氧化作用发育24h的皮肤荧光斑马鱼,使用链霉蛋白酶脱去其胚胎外层的卵膜后随机分成空白对照组(NC)、5mmol/L甲硝唑造模组(MC)、阳性对照组(5mmol/L甲硝唑+μg/mLVc)(PC)、1μg/mL红枣多糖组(I)和25μg/mL红枣多糖组(II),在荧光显微镜下观察拍照。使用Imageproplus软件统计斑马鱼的皮肤荧光点数量,并利用GraphPad软件对数据进行统计分析,评估样品的抗氧化活性。
3.3统计学分析试验平均操作3次,数据以x??±s表示,使用SPSS软件进行单因素方差分析,P0.05表示差异有统计学意义。
4.结果与分析
功率~W时,多糖提取率升高,当超声功率继续加大时,多糖提取率反而下降,由于超声功率增大有助于细胞壁的破碎和液固两相的相互混合,多糖提取率增大,功率过强时,超声波空化作用加大,多糖糖苷键可能遭到破坏,影响多糖提取率。因此超声功率以W为宜。温度低时,分子运动慢使得多糖无法充分溶出,随温度升高,分子运动加快,多糖提取率升高。但是温度升高到50℃以上时,随温度升高多糖提取率反而降低,这可能因为温度升高影响多糖稳定性,多糖糖链降解,多糖提取率降低。因此,适宜红枣多糖提取的温度为50℃。溶剂较少时不利于多糖扩散。随液料比增大,多糖提取率升高,在液料比15∶1时达到最大值。随后提取率降低,随着溶剂增加,多糖尽可能游离到溶液中,但溶剂量过大,大量杂质也会溶出,挤占多糖空间,导致提取率不升反降。因此,最适宜的液料比为15：1。
转载请注明：http://www.abuoumao.com/hyfw/9062.html
