核酸PROTACs,或将青出于蓝
近年来，核酸药物蓬勃发展，市场需求不断增加，获批上市速度飞快，覆盖了心血管与代谢性疾病、肝脏疾病以及肿瘤等多个领域。迄今为止，全球已有10余个核酸药物获批上市，多款核酸药物正处于临床试验阶段，核酸药物有望成为继小分子化药和抗体药物后的第三大类型药物（图1）。越来越多已获批准的核酸疗法证明了通过在体内靶向致病基因来治疗疾病的潜力。通常，常规治疗只会产生短暂的治疗效果，因为它们针对的是蛋白质而不是致病根源，而核酸药物直接作用于致病靶基因或者靶mRNA，在基因水平上发挥治疗疾病的作用。核酸药物包括ASO、siRNA、Aptamer、miRNA、mRNA、saRNA、sgRNA、U1snRNA等。核酸药物具有治疗效率高、药物 性小、特异性强和应用领域广等优点，彰显出其在医学、生物科学等领域的重要价值。
图1.已上市的核酸药物（数据来源：pharmSnap全球新药竞争情报库)
PROTACs（proteolysis-targetingchimeras）（进入数据库pharmsnap.cn搜索PROTACs全球药物数据）是一种利用泛素－蛋白酶体系统（Ubiquitin-ProteasomeSystem,UPS）对靶蛋白进行降解的药物开发技术。在结构上，PROTACs包括三个部分：一个E3泛素连接酶配体和一个靶蛋白配体，两个活性配体通过特殊设计的“Linker”结构连接在一起而形成的三元复合体。PROTAC的靶蛋白配体和靶蛋白结合，E3泛素连接酶配体和细胞内的E3泛素连接酶的底物结合区结合，通过对靶蛋白泛素化，从而将靶蛋白“拉近”到E3泛素连接酶，实现UPS系统将靶蛋白降解（图2）。
图2.PROTACs介导的蛋白降解机制
在过去的20多年里，研究人员基于多肽和小分子设计了多种形式的PROTACs。然而，基于多肽的PROTACs存在活性较低，免疫原性等问题，极大地限制了其在临床上的医学应用。相比于多肽PROTACs，小分子PROTAC分子更小，更容易被人体吸收，具有更好的成药性，因此小分子PROTACs仍是主流。随着科技的发展与进步，一些新型的PROTACs不断涌现，基于核酸的PROTACs应运而生。
RNA-PROTACs
RNA结合蛋白（RBPs）功能缺陷是许多疾病的根源，用传统药物靶向RBPs已被证明是困难的。RBPs以动态、协调和序列选择性的方式与RNA结合，形成在RNA依赖过程中起关键作用的核糖核蛋白(RNP)复合物。某些疾病是由RBP的基因改变引起的，这些改变会影响它们与RNA的结合。年，JonathanHall课题组首次提出了基于RNA的PROTACs的设计理念，作者成功构建了靶向RBPs（RNA结合蛋白）的RNA-PROTACs。采用小RNA模拟物作为靶向基团，可与RBPs的RNA结合位点特异性结合，PROTACs通过对RBPs泛素化，进而使其被泛素蛋白酶体系统降解。作者对两种RBPs（干细胞因子LIN28和剪接因子RBFOX1）的降解进行了概念验证演示（图2），并展示了它们在癌细胞系中的用途。
图2.RNA-PROTACs的合成及其作用机制
寡核苷酸PROTACs
转录因子(TFs)代表了一类重要的治疗靶标，用于治疗包括癌症在内的疾病。由于TFs缺乏激酶或其他酶中通常存在的活性位点或变构位点，传统的小分子抑制剂很难与其结合，因此，转录因子曾一度被认为是“undruggable”靶标，是难以逾越的技术瓶颈。哈佛大学魏文毅教授与西奈山伊坎医学院金坚教授报道了一种基于寡核苷酸链的“TF-PROTAC”，TF-PROTAC由DNA寡核苷酸与E3连接酶配体通过点击反应连接构成（图3），可选择性地降解致病TFs。TF-PROTAC的选择性取决于所使用的DNA寡核苷酸。
图3.TF-PROTAC的设计策略
作者成功开发了两个系列的基于VHL的TF-PROTAC：NF-κB-PROTAC(dNF-κB)和E2F-PROTAC(dE2F)，可分别有效降解细胞中的内源性p65和E2F1蛋白，并显示出优异的抗细胞增殖作用（图4）。
图4.TF-PROTACs结构及蛋白降解实验
年，Crews课题组同样报道了靶向转录因子（TFs）的寡核苷酸PROTAC：oligoTRAFTACs（图5）。oligoTRAFTACs由与TFs结合寡核苷酸链和E3泛素连接酶配体组成。
图5.oligoTRAFTACs的设计思路
蛋白质印迹实验表明oligoTRAFTACs成功降解了两种致癌转录因子：c-Myc和brachyury。此外，作者发现oligoTRAFTACs可以成功降解脊索瘤细胞系的brachyury，并且在后续的体内斑马鱼模型实验同样表现出较好的降解活性（图6）。
图6.oligoTRAFTACs在斑马鱼模型中的降解实验
基于核酸适配体（aptamer）的PROTACs
核酸适配体（Aptamer）是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA）。通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术（Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX），从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用。年，谭蔚弘课题组首次设计了一种基于核酸适配体AS的PROTAC：ZL（图7）。
图7.ZL的设计与合成
AS可以特异性靶向在肿瘤细胞高表达的核仁素受体，核仁素受体与其配体结合后会进行内化。作者通过体外实验证明了该PROTAC具有较高的水溶性和血清稳定性。此外，作者还发现ZL促进了乳腺癌细胞中核仁素受体-ZL-VHL三元复合物的形成，并在体内外有效诱导核仁素受体降解。随后的细胞增殖和迁移实验表明ZL还可以抑制了乳腺癌细胞的增殖和迁移（图8）。
图8.IP实验、细胞增殖和迁移实验结果
核酸适配体-PROTAC偶联物（APC）
PROTAC是一种富有前景的靶向蛋白降解策略。作为一种有效的靶向蛋白质降解方法，PROTACs在催化特性、高选择性、克服耐药性和对不可成药靶点的有效阻断等方面的表现显著优于传统小分子药物。但PROTACs通常具有高分子量和高疏水性，并且它们的物理化学性质在很大程度上超出了“五规则”（RO5）。因此，将常规的PROTACs开发成药物通常受到其细胞膜通透性差、药代动力学(PK)特性不佳和缺乏肿瘤特异性靶向等限制。
为此，盛春泉课题组提出了核酸适配体-PROTAC偶联物（APC）设计理念，APC由可切割的连接链将靶向BET蛋白的PROTAC与核酸适体AS(AS)偶联得到（图9）。其中，核酸适配体AS可以选择性靶向肿瘤细胞表面高表达的核仁素受体。AS本身对核仁素受体过度表达的肿瘤具有良好的抑制活性，目前正在II期临床试验中进行评估。谷胱甘肽在肿瘤细胞含量丰富，因此连接链选用能被谷胱甘肽（GSH）切割的 键，可选择性地响应肿瘤微环境，切割连接链后释放出活性的BET降解剂。
图9.APC偶联物的设计策略
与未修饰的BETPROTAC（PRO）相比，APC偶联物(APR)在MCF-7细胞的小鼠异种移植模型中显示出改善的肿瘤靶向能力，从而增强了体内BET蛋白的降解和抗肿瘤效力并降低了 性（图10）。因此，APC策略为肿瘤特异性靶向PROTACs药物开发提供了新的设计思路。
图10.蛋白降解实验和体内成像、抗肿瘤实验
综上，核酸PROTACs从提出到现在，其发展可谓是“翻天覆地”。相比于传统的PROTACs，基于核酸的PROTACs提高了传统小分子PROTACs的靶向性，并且在提高水溶性、膜通透性和肿瘤靶向性等方面发挥重要作用。由于核酸药物在体内易被核酸酶水解，半衰期短，大大限制了其在生物医学中的应用。未来的研究方向应聚焦于提高核酸药物的稳定性、延长半衰期、改善药代动力学性质及解决核酸药物递送问题。
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