学术前沿专家点评CellResear

点评

罗凌飞（西南大学）、潘巍峻（中国科学院上海营养与健康研究所）、张辉（上海科技大学）

心血管系统是哺乳动物胚胎发育过程中最早形成并执行功能的系统，由原始血管内皮细胞（VEC）形成的初级血管网逐步发育为包含不同等级分支动静脉和毛细血管的完整血管网络。胚胎最早的动脉（背主动脉）由中胚层前体细胞通过血管发生（vasculogenesis）的方式形成。随后血管发育早期阶段的动脉形成被普遍认为是通过已有动脉产生分支（branching）或未特化毛细血管动脉化（arterialization）的方式。虽然动脉VEC可以通过静脉-动脉命运转化（venous-to-arterialfateconversion）的方式形成，但这种方式仅被报道在特定器官发育（如心脏的冠状动脉形成、视网膜血管发育）和组织再生（如斑马鱼尾鳍的损伤再生）情景中。哺乳动物胚胎血管发育早期，动静脉命运决定的细胞演进和分子事件很大程度上仍不清楚。

年1月25日，暨南大学兰雨研究组、北京大学汤富酬医院第五医学中心刘兵研究组合作在CellResearch杂志在线发表了题为Heterogeneityinendothelialcellsandwidespreadvenousarterializationduringearlyvasculardevelopmentinmammals的研究论文。该研究结合了多种前沿技术（单细胞转录组测序和双遗传谱系示踪技术），涉及了不同哺乳动物物种（人和小鼠）。这是继三个研究组前期合作从转录组（Transcriptome）、免疫表型（Immunophenotype）、功能（Function）三个层面（TIF）精准解析造血干细胞的内皮起源及特化路径，从而开辟了造血发育的TIF研究新模式（详见BioArt报道：CellResearch

兰雨/汤富酬/刘兵合作团队精准解析造血干细胞的内皮起源及特化路径）以来，继续践行并拓展了TIF研究模式，从转录组（Transcriptome）、免疫表型（Immunophenotype）和命运（Fate）三个层面，单细胞水平全面非偏解码了胚胎血管发育早期VEC的异质性和动静脉特化的谱系关系，重构了早期胚内VEC的分子特征模型及动静脉特化模型，为血管发育领域带来了全新认识。

首先，作者使用多种单细胞转录组测序策略（包括STRT-seq和10xGenomics），构建了小鼠胚胎血管发生和血管形成的关键时间窗内（E8.0-E11.0）VEC的高精度单细胞转录组图谱。研究发现VEC在胚内胚外位点的差异相较于发育阶段更加显著；胚内VEC高表达基因与神经形成和动脉发育相关，而胚外VEC则与细胞粘附、运输等膜的活性相关，这表明胚胎VEC与其邻近细胞共享某些基因表达特征而参与相似的生物学过程。相较于胚外卵黄囊，胚内的VEC群体具有更显著的动静脉特征偏向性。作者进一步识别了胚内的8个VEC群体（EP0-EP7），EP0主要由E8.0的VEC构成，为原始VEC，EP1和EP6显现出不同程度的静脉特征，EP2/EP3/EP5/EP7四个群体显示出不同程度的动脉特征。EP4为生血内皮细胞群体故未纳入下一步对VEC发育的解析。

接下来，作者利用四种荧光报告小鼠，包括两种自主构建的泛动脉VEC的基因敲入荧光报告小鼠模型（Dll4-tdTomato和Unc5b-tdTomato），建立了一套缜密的免疫表型标志组合，涉及不同动静脉特征VEC的甄别标志，从而将每一种转录组识别的VEC群体都进行了精确的解剖学定位认定。EP1和EP2分别被认定为早期血管丛VEC和早期动脉VEC。EP3和EP5分别定位于E9.5-E10.0和E10.5-E11.0的主要动脉及其近端分支，被认定为主要动脉VEC。由此，由EP2经历EP3到EP5代表了主要动脉发育过程中的细胞演进过程。EP6主要分布在典型的静脉结构（如主静脉）及其附近的血管丛，结合其显著的静脉特征，被认定为静脉及静脉血管丛VEC。EP7主要分布在主要动脉的远端分支以及与EP6相邻的血管丛，表达Dll4、Unc5b等动脉标志但不表达主要动脉标志如CD44等，作者将其认定为动脉血管丛VEC。重要的是，作者将利用免疫表型标志组合捕获的不同VEC群体又进行了转录组测序，将其投射到原始UMAP图上，验证了其与最初转录组认定群体的完美契合。综上所述，这些认识改写了在不同血管结构上VEC分子特征的传统模型。新模型突出了胚内早期血管系统的显著动静脉特征及其不对称性，强调了仅从形态上难以区分的血管丛VEC也存在明显的动脉或静脉特征。

接下来，作者揭示了主要的VEC类型在人和小鼠胚胎血管发育过程中的进化保守性；转录组水平证实了人和小鼠血管发育早期阶段的胚内都存在两种分子特征不同的动脉VEC群体，即主要动脉VEC和动脉血管丛VEC，并进一步发掘了人鼠保守的不同动静脉群体的标志基因，包括两种动脉VEC群体特异的以及泛动脉VEC群体共享的保守基因。

进一步，作者利用多种算法一致地预测了从原始VEC（EP0）起始的两种动脉命运特化路径。一种是主要动脉的发育路径，经历早期动脉VEC（EP2）以及成熟中的动脉VEC（EP3）最终走向成熟动脉VEC（EP5）的特化；另一种是动脉血管丛VEC的发育路径，经历早期血管丛VEC（EP1）以及静脉及静脉血管丛VEC（EP6）最终发生静脉到动脉的命运转化形成动脉血管丛VEC（EP7）。而且，在转录组层面这两种动脉特化路径在人和小鼠之间是保守的。

最后，为了验证计算预测，作者选择经典静脉基因Nr2f2构建了Nr2f2-CrexER基因敲入小鼠模型以实现体内遗传谱系示踪。作者首先验证了CreER所代表的Nr2f2在E8.0-E9.5的表达，发现CreER在E8.0并不表达在原始VEC中，E8.5以后具有与动脉标志Dll4完全互斥的VEC分布特征，证实了其在静脉而非动脉VEC或者原始VEC的表达模式。由于Nr2f2还在VEC以外的细胞类型中表达，作者又引入了双同源重组系统Tie2-Dre;Nr2f2-CrexER小鼠模型，使得Cre介导的重组事件仅发生在表达Nr2f2的VEC中从而实现所示踪血管结构的全景可视化。作者发现，利用组成型Tie2-Dre;Nr2f2-CrexER模型，以及Nr2f2-CrexER在E8.5和E9.5的诱导，均可以观察到谱系标记的细胞广泛分布在除了主动脉以外的血管结构，包括广泛贡献了Unc5b阳性或Gja5阳性而不表达静脉特征（Nrp2或者CreER）的主要动脉分支以及动脉血管丛VEC。作者进一步将谱系标记的细胞分选下来进行了转录组测序，发现绝大多数谱系标记并表达动脉标志Unc5b或者Gja5的VEC失去了Nr2f2的表达，与动脉特征群体聚集在一起，从而从分子层面确认了静脉VEC向动脉VEC身份的转变。综上所述，研究在国际上首次揭示了胚胎发育过程中最早发生以及最广泛存在的静脉-动脉命运转化事件。改写了胚内血管发育早期阶段动静脉形成方式的传统模型。

除此之外，该研究具有重要的资源价值。首先，这应是迄今为止哺乳动物胚胎血管发育早期最为完整和全面的VEC单细胞转录组图谱（包括从只小鼠胚胎和8个人胚中取样的10,多个VEC单细胞转录组数据）。重要的是，该研究中转录组认定的所有VEC群体都经过了免疫表型和组织学的认定和回溯到转录组的再验证。其次，基于单细胞数据集的挖掘，作者开发了一系列有价值的动静脉VEC相关的小鼠模型，包括两种泛动脉VEC的荧光报告小鼠模型和两种静脉VEC的Cre小鼠模型，这将极大助力未来血管生物学领域的研究。

兰雨研究员、汤富酬研究员和刘兵研究员为该论文的通讯作者。侯思元博士、李宗城博士、董骥博士、高云博士、博士研究生常志林和博士研究生丁晓晨为该研究论文的第一作者。周斌研究员为谱系示踪实验提供了珍贵的小鼠模型和宝贵的建议。

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