MICDrop见微知著大规模体内功能性

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酶美CRISPR-Cas9技术在体外培养的细胞中已经可以用于大规模的筛选，但是CRISPR筛选想要在动物体内进行仍然是很大的挑战，因为大量携带突变的动物的产生、鉴定以及持续追踪并非易事。为此，美国犹他大学RandallT.Peterson研究组在Science发文题为MIC-Drop:Aplatformforlarge-scaleinvivoCRISPRscreens，通过多组分显微注射的CRISPR液滴的方式建立了一个可以用于在脊椎动物中的大规模功能性筛选的实验平台，并将该平台称为MIC-Drop（MultiplexedIntermixedCRISPRDroplets）。以前，想要在斑马鱼上进行大规模的遗传筛选主要采用的是化学诱变或者是插入突变的方式。这些筛选鉴定出了调节脊椎动物发育和行为的关键信号途径。但正向遗传学的方法耗时耗力，需要多年的时间才能将表型与基因型相联系。反向遗传学的方式比如CRISPR技术能够克服正向遗传学的局限性，但是目前在动物体上应用的通量有限。迄今为止在斑马鱼上进行的靶向筛选基因的数目是个。因此，作者们希望将筛选的规模扩大到全基因组范围。作者们所建立的MIC-Drop技术主要采用的方法是显微注射，将纳升大小、包含Cas9、靶向目标基因的多通道gRNAs以及与靶点基因相连的一个独特的条形码的液滴同时注射到斑马鱼之中（图1）。这个小小液滴可以靶向数以百计至数以千计的不同的基因，并且通过一个小小的针头就可以注射到斑马鱼的胚胎之中。胚胎可以被一起培养，然后将出现感兴趣的表型的胚胎进行分离，从而可以通过条形码的测序来确定被破坏的基因。图1MIC-Drop的实验流程为了达到最好的注射效果，作者们检测了不同的表面活性剂与油的组合，鉴定发现了一种氟化油（Fluorinatedoil）以及含氟表面活性剂可以达到最佳的液滴产生效果，此条件下的液滴比较比较均匀，大约um的大小。对于MIC-Drop系统效果的最初检测液滴中包括四个gRNAs，四个gRNAs靶向八个基因，可以造成高效地双等位基因突变的引入。作者们发现突变的表型在F0的斑马鱼胚胎中出现了70-%，该结果说明该注射过程没有显著的毒性，另外也不会因为注射而引入其他的发育形态上的缺陷。另外，作者们将液滴的贮存液进行长时间的储存，发现液滴在4℃存放一个月后仍然有很高的渗透性与外显率。随后，作者们想检测MIC-Drop是否能够从备选基因中鉴定发现特定表型所对应的基因型。因此，作者们将目标基因混入混序gRNAs（ScramblegRNAs）之中，占注射gDNAs总量的2%左右。作者们发现可以看到约1.7±0.8%以及2.2±0.8%比例的靶标基因的表型出现。因此，表型与基因型的对应筛选关系在MIC-Drop系统中是非常准确的。在化学生物学以及制药学方面，对于小分子药物的蛋白靶标的鉴定是一项巨大的挑战。作者们想知道MIC-Drop能否用于鉴定小分子的靶标。为此，作者们使用了optovin这个小分子，是靶标基因trpa1b通道的激活剂，可以对斑马鱼中的光激活行为进行修饰。还是利用相似的将目标基因混入混序gRNAs（ScramblegRNAs）之中的方式1:20进行注射，然后进行胚胎中的液滴注射，并在96孔板中进行检测，随后加入optovin的处理，其中约2-3%表现出了光诱导的运动神经元响应缺失，还有额外的2%表现出一定程度的响应可能是由于trpa1b通道功能的不完全缺失。因此，MIC-Drop平台可以作为小分子药物的筛选工具。进一步的，作者们想知道能否用MIC-Drop进行大规模的、反向遗传学的筛选从而鉴定发现与心血管系统相关未知调节因子。先天性心脏病（Congenitalheartdisease，CHD）是人类中最常见的出生缺陷，会影响到约1%的新生儿。通过MIC-Drop平台作者们共鉴定发现了13个新基因，这些基因的缺失会造成心血管中的表型，比如卟啉症、心律不齐以及心胶质的形成缺陷等等。另外，作者们通过mRNA注射回补挽救实验证明了该筛选得到的备选基因并非脱靶效应造成的。总的来说，该工作建立了一种可以在脊椎动物中进行的、显微注射为基础的大规模CRISPR筛选技术平台，弥补了CRISPR筛选只能在体外培养细胞中进行的不足。同时MIC-Drop技术在小分子药物筛选方面的应用进一步扩大了该平台的使用范围。通过MIC-Drop的筛选，作者们还鉴定发现了与心血管疾病相关的新基因。这些发现对于人类先天性心脏病的研究提供了新的参考。正所谓“小液滴，大功用”，相信该技术将会为多种疾病相关的目标基因的大规模无偏筛选提供重要的工具。原文链接：

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