专家点评真核生物dsDNA6mA去甲基化

蒋华良（中国科学院院士）、徐国良（中国科学院院士）责编

兮N6-甲基脱氧腺嘌呤（6mA）是DNA腺嘌呤6号位氮原子上的甲基化修饰，在多种生命体中具有重要的生物学调控功能（图1a）。最初，6mA被发现主要存在于原核生物基因组中，用于区分自身基因组和外源DNA，保护自身DNA不被限制性内切酶性降解。近年来，6mA逐渐被发现存在于真菌、衣藻、果蝇和哺乳动物等真核生物基因组（gDNA）和线粒体DNA（mtDNA）中，其动态水平的变化调控了早期胚胎发育及线粒体转录，提示6mA是真核生物基因组中继5-甲基胞嘧啶（5mC,DNA甲基化）之后的又一个全新的表观遗传修饰，阐明其甲基化酶和去甲基化酶的分子机制对于深入理解6mA的基本生物学功能具有重要意义。年6月2日，上海交通大学医学院张良研究员团队联合上海中医药大学陈红专教授团队在NatureChemicalBiology杂志上发表了题为AfungaldioxygenaseCcTetservesasaeukaryotic6mAdemethylaseonduplexDNA的研究论文，发现真菌双加氧酶CcTet是一种真核生物dsDNA6mA去甲基化酶。灰盖鬼伞菌（Coprinopsiscinerea）是一种常见的真菌蘑菇，其基因组上存在大量的5mC和6mA修饰，且随着其生长周期变化呈现动态分布。张良研究员前期工作中已发现灰盖鬼伞菌双加氧酶CcTet通过将基因组上5mC逐步氧化成5hmC、5fC和5caC来参与DNA5mC去甲基化调控（JACS,,,-）。目前研究工作进一步揭示了CcTet识别和催化dsDNA上6mA底物的分子机制，并发展了具有6mA去甲基化活性的单功能CcTet突变体DF，为进一步研究真核生物6mA的调控机制和功能提供了新的化学生物学工具。NatureChemicalBiology在同期还配发了专家点评文章，对该工作进行了详细介绍和评论。通过对CcTet潜在底物进行大量筛选，发现CcTet对dsDNA上的6mA具有显著的去甲基化活性（图1b），并对C-6mA-G序列具有更高的底物偏好性，这与之前报道的多种真核生物基因组6mAmotif序列吻合。同时，CcTet在体外（灰盖鬼伞菌gDNA和绿藻gDNA）和体内（大肠杆菌中异源表达）也表现出了较高的基因组6mA去甲基化活性。为阐明CcTET的6mA去甲基化分子机制，进一步解析了CcTet及CcTet与含有6mA修饰的短链dsDNA的复合物晶体结构，揭示CcTet通过3个柔性Loop区域特异识别dsDNA，并利用活性袋中两个关键氨基酸Gly和Asp选择性识别和催化6mA碱基的分子机制（图1c）。同时，通过与人源5mC去甲基化关键双加氧酶TET2比较发现，TET2活性口袋中与CcTetGly对应的氨基酸Asn侧链阻挡了TET2对6mA底物的容纳，将TET2Asn突变成无侧链的Glycine，则能使TET2获得6mA的去甲基化活性。此外，通过与RNAm6A去甲基化酶FTO比较则发现，CcTet与FTO采用了截然不同的核酸单双链识别机制，底物碱基进入活性口袋的方向也因此发生了约90度的变化，造成FTO不能催化dsDNA的6mA去甲基化。为获得具有区分dsDNA上5mC和6mA底物的单功能6mA去甲基化酶，开展了基于结构的定向进化筛选，通过对活性口袋中关键氨基酸突变体进行活性筛选和Dotblot实验验证，发现CcTetDF在保持6mA去甲基化活性的同时，丧失了对5mC的催化活性。因此，CcTetDF可以被进一步开发成能特异性作用于6mA而不受其他修饰（如5mC）干扰的化学生物学新手段（图1d）。图1.dsDNA6mA去甲基化酶CcTet的分子机制上海交通大学医学院药理学和化学生物学系张良研究员、上海中医药大学上海市中药化学生物学前沿科学基地陈红专教授和上海交通大学医学院博士后张琳为该论文的共同通讯作者。上海交通大学医学院20级博士生穆雅娟、博士后张琳和21级博士生胡静燕为该论文的共同第一作者。该研究工作受到芝加哥大学何川教授、上海交通大医院林厚文教授和南京师范大学刘中华教授等指导和大力支持。专家点评蒋华良（中国科学院院士，中科院上海药物研究所）自年以来，随着高灵敏度检测技术（如生物质谱）和测序技术的发展，在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）、衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）、果蝇（Drosophilamelanogaster）、真菌（Fungi）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）和水稻（Rice）等多种真核生物基因组上陆续发现了N6-甲基脱氧腺嘌呤（6mA）的存在。更重要的是，多种脊椎动物（斑马鱼、小鼠、猪和人）基因组DNA和线粒体DNA上也检测出了相当丰度的6mA，且6mA分布随着生物不同发育阶段呈现动态变化，从而动态调控早期胚胎发育及线粒体转录。此外，6mA修饰水平的异常与多种人类疾病例如胃癌、肝癌、肺癌和脑胶质瘤的发生发展也密切相关。越来越多的证据表明，6mA的分布受甲基转移酶和去甲基化酶动态调控，但已报道的6mA去甲基化酶对于双链DNA上6mA的去甲基化酶活性较弱。张良团队发现了灰盖鬼伞（Coprinopsiscinerea）蘑菇类真菌双加氧酶CcTet，不仅具有对双链DNA上5mC的氧化活性，还在体外和体内均体现出对基因组上6mA修饰的显著去甲基化活性，是双链DNA6mA的去甲基化酶。该团队通过解析CcTet-6mA-dsDNA复合物结构，阐明了CcTet利用3个loop特异性识别双链DNA并通过活性口袋中两个关键氨基酸Gly和Asp催化6mA去甲基化的分子机制。同时，通过对关键氨基酸的定向进化，发展了仅具有6mA去甲基化活性的突变体CcTetDF，可应用于后续6mA生物功能的研究。真核生物尤其是高等哺乳动物（包括人）体内的DNA表观遗传修饰调控与生长发育和疾病的发生发展存在潜在的关联。过去几十年的相关研究主要集中在5mC这类修饰上。而近年来6mA修饰的发现为该领域的研究打开了一扇新的大门。该研究首次阐明了真核生物dsDNA6mA去甲基化酶的底物识别和催化分子机制，发展了可应用于后续6mA生物功能研究的化学生物学新工具（CcTetDF），为该领域的发展起到了积极的推动作用。专家点评徐国良（中国科学院院士，中科院上海生化细胞所）近年在真核生物DNA中发现了腺嘌呤6位氨基上的甲基化修饰（6mA）。已被报道的能去除这一修饰的去甲基化酶，主要是在果蝇中发现的DMAD蛋白、哺乳动物中发现的ALKBH1和ALKBH4蛋白，它们都属于双加氧酶家族。值得一提的是，它们对于双链DNA的6mA氧化去甲基化酶活并不高，比如ALKBH1偏好于催化非配对的DNA底物以及单链DNA，因而对于6mA去甲基化酶的确定，还存在一定的疑问。张良团队首次发现来自于灰盖鬼伞(Coprinopsiscinerea)蘑菇类真菌的哺乳动物TET双加氧酶同源蛋白CcTet，不仅可以氧化双链DNA中的5mC，而且对于双链DNA的6mA具有很强的氧化活性。通过解析蛋白DNA复合物结构，他们发现CcTet蛋白通过三个灵活的环形结构（loop）结合双链DNA和固定并催化6mA碱基，其中位的缬氨酸（Val）推动6mA翻转进入酶催化活性中心。位的甘氨酸（Gly）以及位的天冬氨酸（Asp）特异性负责促进6mA氧化，这明显地与其它TET酶不同。这些证据说明CcTet蛋白的确可以负责DNA中6mA的氧化去甲基化。从生化性质上说，CcTet蛋白是真正意义上的双链6mADNA去甲基化酶，但是它在真菌细胞内如何协调5mC以及6mA氧化去甲基化以及具有怎样的生物学意义，还有待于依赖基因剔除的实验进行探索。除了真菌，单细胞真核生物衣藻（Clamydomonas）基因组DNA中也同时含有6mA和5mC两种修饰。我们组年的工作发现（何川点评Nature

中科院/复旦合作团队发现维生素C可直接参与真核生物的DNA修饰），衣藻Tet同源蛋白催化5mC甲基上加上甘油基，产生被称作5gmC的修饰，引发被动去甲基化。这些观察结果放在一起，提示Tet双加氧酶基因在不同物种中存在着趋异进化。张良团队的最新工作揭示，促进5mC与6mA氧化去甲基化的加氧酶，尽管在分子功能上有很大差异，但在进化上可能存在共同的起源。原文链接：

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