Cell新技术双管齐下细胞谱系追踪与单细

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十一月

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细胞谱系追踪技术对于揭开多样的、基础的生物学过程中的分子机制是非常关键，因此一直以来建立能够在体内进行追踪细胞谱系的动物模型是生物学研究的一个长期目标。

在早期的一些研究中，哺乳动物的谱系追踪仅限于通过使用染料或荧光标记对一小部分细胞进行追踪，虽然这些技术一定程度上解决了早期发育过程中细胞谱系中命运决定的一些关键性问题，但是可供分析的细胞数量较低这一缺点大大限制了人们对于组织中干细胞在发育中的动态变化过程的研究。

CRISPR-Cas9基因编辑技术为细胞谱系追踪在体内的应用打开了一扇大门。

为了同时获得组织中进行细胞谱系历史与转录组信息，近日，医院FernandoD.Camargo研究组与丹娜-法伯癌症研究所SahandHormoz研究组合作在Cell发表Resource文章，题为AnEngineeredCRISPR-Cas9MouseLineforSimultaneousReadoutofLineageHistoriesandGeneExpressionProfilesinSingleCells。

建立了一种基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的可诱导型细胞谱系追踪小鼠模型，为体内进行谱系追踪以及单细胞转录组分析提供了重要的工具。

最早将CRISPR-Cas9基因编辑技术应用到细胞谱系追踪上的成功案例是斑马鱼胚胎。CRISPR-Cas9基因编辑技术通过非同源末端链接的方式可以产生大量独特的、可遗传的DNA条形码（Barcode）。

CRISPR-Cas9基因编辑技术通过非同源末端链接的方式可以产生大量独特的、可遗传的DNA条形码（Barcode）。

但是目前已有的方法都需要利用组成型表达的Cas9并且使用多个靶标条形码阵列来产生多样性，这样就要求每次进行胚胎操作来产生不同的小鼠品系。

而且由于随机插入的转基因数量很高，产生的小鼠都无法进行繁殖。这些模型的局限性使得进一步在成体中使用以及细胞谱系追踪变得很困难。

因此，作者们希望建立一种可诱导的、基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的细胞谱系追踪小鼠模型，可以根据需要进行诱导、包含大量的DNA条形码来提供多样性并且同时可以在小鼠成年时期可以同样使用。

为了达到追踪细胞谱系并在单细胞水平进行基因表达谱分析的双重目标，作者们基于斑马鱼胚胎中谱系追踪技术设计了10个sgRNA（singleguideRNA），确保在Cas9存在的情况下有效地切割靶位点。

作者们以二次迭代的方式设计gRNA，其中一个在U6启动子驱动的情况下表达gRNA，第二个在每个gRNA上游携带tetO操纵子。分子示踪阵列的组成型表达基于组成型CAG启动子驱动的荧光蛋白。

所有这些元件通过重组酶介导在小鼠胚胎干细胞进行整合，一起插入到广泛使用的Col1a1位点中，同时也表达Rosa26启动子驱动的一种增强型反四环素转活化因子(M2-rtTA)（图1）。

最后作者们会通过这些小鼠胚胎干细胞来产生所需要的小鼠品系。

为了对Cas9表达进行时间上的控制，作者们分别产生表达整合在Col1a1位点上的tetO-Cas9的小鼠品系以及整合在Rosa26位点上的M2-rtTA小鼠品系，最后将两种小鼠品系进行杂交，产生携带以上所有转基因元件的CARLIN小鼠胚胎干细胞和CARLIN小鼠品系。

最终，作者们使用多西环素（Doxycycline,Dox）诱导来控制Cas9基因的表达，促进靶点阵列双链DNA的断裂。这些断裂被修复，导致各种各样被改变的DNA序列也就是CARLIN等位基因被表达和稳定遗传。

作者们对CARLIN系统进行检测后发现，该品系能够产生1-bp范围的基因删除，也能产生长度不超过51bp的基因插入。

而且基于多西环素的诱导时间以及诱导幅度的影响，可以对基因编辑的程度进行控制，因此CARLIN小鼠品系可以作为一个可控制的谱系追踪平台。

而且，CARLIN小鼠模型可以产生44,±个等位基因，是一个具有高度多样性的系统。

并且在多西环素的诱导下，可以对细胞群中的单个细胞进行CARLIN靶标扩增并进行测序，可以单细胞水平上对CARLIN等位基因进行分析（图2）。

图2CARLIN平台应用实例：对骨髓细胞进行单细胞基因组分析聚类

利用CARLIN技术，作者们希望对药物治疗之后淋巴/骨髓细胞清除之后造血细胞补充过程进行研究。

在对小鼠品系进行5-氟尿嘧啶药物处理后，CARLIN小鼠品系中造血细胞的多样性减少，但是只有很小数量的造血干细胞会对血细胞进行补充。

这可能是造血过程再生中的瓶颈。而CARLIN技术应用鉴定得到的潜在与造血干细胞静息状态与激活状态之间调控过程的靶点基因可能会帮助解决造血干细胞再生过程中遇到的问题。

总的来说，该工作建立的以CRISPR-Cas9基因编辑技术为基础的CARLIN小鼠品系能够在系统发育过程中进行谱系追踪、对细胞群进行异质性分析同时能够在多西环素诱导的情况进行基因编辑幅度的控制，是一个允许在体内同时进行细胞谱系追踪与单细胞水平转录组分析的小鼠模型，为多种细胞谱系的研究提供了重要的工具平台。

制版人：琪酱

参考文献

1.Kretzschmar,K.Watt,F.M.Lineagetracing.Cell,33-45,doi:10./j.cell..01.().

2.McKenna,A.etal.Whole-organismlineagetracingby

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