马里亚纳海沟狮子鱼的形态学和基因组为深海
MHS的采样信息和形态特征。采用单分子实时测序和双末端测序相结合的方法对MHS个体进行测序。组装包括6,个scaffolds，scaffoldsN50为kb，contigN50为kb。对单拷贝同源基因的BUSCO评估表明，该基因组的完整性为91.7%。通过对15种组织的28个样本的mRNA进行测序，进一步证实了基因组的完整性。基因组数据注释了个蛋白质编码基因，其中个（91.2%）得到了转录组数据的支持。为了进行比较分析，研究者还对Tanaka’s深海鱼基因组进行了重头组装。MHS的基因组比Tanaka’s深海鱼基因组大21.9%（Mb）。这可能主要是由于重复序列的扩增。MHS基因组的其他特性，包括其GC含量、密码子使用、基因长度和外显子数量类似于海洋表面狮子鱼的基因组，这表明它们可能对深海适应性没有很大贡献。研究者用9种硬骨鱼构建了一个高可信度的物种树（图2a）。据估计，MHS和Tanaka’s狮子鱼之间的分化时间约为万年前（Ma）（图2a），比马里亚纳海沟的形成（估计发生在8-10Ma）早10多年。狮子鱼是已知的海沟区域主要鱼类，也是顶端的捕食者。因此，MHS可能有一个相对较大的种群规模。相应地，其杂合度约为0.36-0.51%大于Tanaka’s狮子鱼的杂合度（0.26%），与其他硬骨鱼类相当。对两个物种的动态有效种群数量（Ne）的估计表明MHS的种群数量比表面狮子鱼更大，并在5万年前经历了一次显著地种群扩张（图2b）。这个扩张被多次连续的马尔可夫结合分析证实，可能与一些未知的地理或环境事件有关。三个个体所代表的三个（亚）种群之间的分化时间被估计为~1.4和~2.9Ma。这些结果表明MHS种群是相当大的，且具有丰富的遗传多样性。在最大似然树中，MHS的分支长度约为Tanaka’s狮子鱼的三分之一。MHS整个基因组的突变率也低于Tanaka’s狮子鱼和棘鱼（图2d）。以前的研究表明突变率对许多因素都很敏感，包括环境能量、新陈代谢率、生活史特征，尤其是世代时间。据报道，深海物种的新陈代谢率相对较低，因此MHS可能有一个"慢生活"。研究者观察到雌性MHS比其他狮子鱼的雌性产卵少但较大，这表明它们可能有专门的繁殖策略，这可能会进一步延长世代时间，而这有助于其低突变率是很合理的。尽管MHS的核苷酸水平突变率低，但其蛋白质序列的进化速度似乎与其他物种相似。虽然MHS的Ks值（每个同义替换位点的突变数）明显低于Tanaka’s狮子鱼，但这两个物种的Ka值（每个非同义替换位点的突变数）非常相似，因此MHS的Ka/Ks比率（即ω）明显更大（图2e-g）。通过比较棘鱼染色体上的ω分布，证实了MHS具有较高的蛋白质进化速率。图2
MHS的进化史。生活在地球表面的脊椎动物用硬骨包围封闭的颅骨，以保护大脑并保持适当的颅内压力。然而，封闭的颅骨在海沟高压环境下不能保持其结构的完整性，因此需要一个开放的系统。只有少数脊椎动物和MHS表现出适应这个环境的结构特征。使用微型计算机断层扫描发现MHS的头骨不是完全封闭的（图3a,b），大部分的骨头由软骨组成。值得注意的是，研究者发现骨钙蛋白基因（bglap）有一个移码突变，这可能导致MHS中软骨钙化的过早终止（图3c）。为了评估破坏鱼类中bglap功能之后的影响，使用两种特异性反义吗啉（MO）寡核苷酸敲除斑马鱼（Daniorerio）中bglap的表达。受精后5天的斑马鱼胚胎，与对照组相比，MO处理组的胚胎中染色矿化组织的数量显著减少(图3d-g)，表明干扰bglp表达确实会阻碍鱼的骨骼发育。因此，MHS中bglap的过早终止可能与该物种独特的头骨结构和骨质硬度降低有关。图3
MHS的不完整头骨与bglap基因提前终止有关。海底7,米的环境几乎完全没有光线。研究者对深海狮子鱼的晶状体蛋白和视蛋白基因的变化进行了比较基因组分析，发现它已经失去了几个重要的光感受器基因。在转录组数据中，只有五个基因表现出明确的表达信号，其中三个（rho、rgra和rgrb）在头部特异表达。由rho编码并由rgr负责再生的Rhodopsin是一种极度光敏的受体蛋白，存在于杆状细胞中，负责感受弱光。研究者假设MHS可能保留了一些光子感应能力，或者逐渐失去了视觉能力--首先是失去了颜色感知能力，然后是失去对任何形式光的感知能力。像其他生活在黑暗中的鱼类一样，MHS已经失去了皮肤色素，变得透明。细胞膜是含有各种蛋白质的脂质双分子层。高静水压力降低了脂质双层的流动性和其相变的可逆性，最终导致了膜相关蛋白的变性和功能紊乱。压力也会使膜僵化，损害其运输功能。对9种硬骨鱼的基因家族分析显示，MHS中有个明显扩张的基因家族。其中扩张最明显的基因家族与脂肪酸代谢（图4a）。磷脂是细胞膜的主要成分，它们的脂肪酸组成被调节以维持膜的秩序和流动性。研究表明深海适应性生物的细胞膜含有的不饱和脂肪酸的重量百分比高于浅海物种的细胞膜。已有研究表明，二十二碳六烯酸（DHA）明显地改变了膜的许多基本特性，包括芳烃链顺序和"流动性"、弹性压缩性、渗透性和高压下的蛋白质活性。DHA生物合成的最后一步是过氧化物酶体的β-氧化，由acaa1编码的蛋白质乙酰-CoA酰基转移酶是这个过程中的限速酶。MHS的基因组有15个acaa1基因拷贝，而其他硬骨鱼只有5个拷贝（图4b）。另一个参与DHA生物合成的基因fasn，在MHS基因组中也表现出拷贝数的增加。这些变化可能会增加流体膜脂质的丰度，使其在世界最深的海沟中生存。其他显著扩张的类别包括具有离子和溶质运输相关功能的家族基因，如tfa和slc29a3。这与抵抗高压诱导的液体运输的需要相一致。扩张的基因家族名单为未来的功能测试提供了线索，以揭示其与MHS对极端静水压力的适应性。MHS广泛的深海适应性可能是由于作用于不同基因家族的强烈选择压力。GO富集分析显示，与Tanaka’s狮子鱼相比，MHS的蛋白质进化率明显更高，包括"离子运输"、"跨膜运输"和钙离子运输"（图4c）。86个MHS基因被确定为正选择基因（PSG），也表现出“跨膜运输”、"ATP结合"和"离子运输"方面的功能富集。在这些PSG中，79个具有众所周知的功能，其中18个与膜运输系统有关，包括3个ATP依赖性转运蛋白、4个离子通道基因和11个二次转运体基因。早期的研究表明，高压会抑制膜运输基因的活性，如深海物种的Na+/K+-ATP酶蛋白对压力的敏感度低于海面物种。因此，这些基因在MHS中的谱系特异性适应性进化可能表明它们在维持转运活性和细胞稳态方面发挥了作用，帮助鱼类在高压下茁壮成长。图4
MHS基因组中的基因家族扩展和适应性进化。静水压强烈地抑制蛋白质功能，影响其折叠和酶活性。因此，生活在海沟的物种必须保持一个细胞内的环境，以保持蛋白质的固有特性并赋予其抗压性。生理适应机制包括积累小的有机溶质，如三甲胺N-氧化物（TMAO），以便在升高的静水压力下保存蛋白质功能。TMAO是一种生理学上重要的蛋白质稳定剂，可以使变性的蛋白质恢复到其原始结构。它在硬骨鱼中的丰度随着深度的增加而增加；深海捕捞的物种中所有组织的TMAO水平明显高于浅海物种。大多数硬骨鱼的基因组包含生成TMAO酶黄素单氧酶3（fmo3）的五个拷贝，其中四个是串联重复的（图5a）。这四个串联重复拷贝中的第一个基因(fmo3a)在MHS的肝脏中强烈表达。MHS的fmo3最强表达的拷贝在不同的物种之间有所不同。这可能受到转录组降解的影响。由于这些拷贝在很久以前就发生了分化，而且相应的蛋白质的结构也有明显的不同，因此fmo3的不同拷贝很可能具有不同的催化效率。有趣的是，fmo3a在MHS中被正向选择。此外，研究者预测MHS中该基因假定的启动子(5个拷贝)上游要多于Tanaka’s狮子鱼(1个拷贝)或刺鱼(2个拷贝)。这些基因的蛋白质编码和调控序列的变化可能有助于MHS提高细胞内氧化三甲胺水平，从而提高蛋白质的稳定性。蛋白质对深海环境的结构适应可能包括氨基酸替代模式和蛋白质结构的变化，这些变化抵消了压力对蛋白质功能的影响。为了描述这些适应性，研究者比较了MHS与其他物种的所有编码基因和每个基因的氨基酸组成和替换。在该分析中未发现明确的信号，表明在所有蛋白质中不存在整体组成和替代变化。然而，以前曾有报道，一些蛋白质的进化模式对静水压有反应。研究者进一步研究了MHS的任何基因家族是否在同源位置存在与祖先基因型不同的聚合氨基酸取代。唯一一个在其家族成员中表现出高度可信的收敛性氨基酸变化的基因家族是hsp90；在MHS的hsp90蛋白的五个拷贝中，有四个拷贝独立发生了相同的丙氨酸到丝氨酸的替换，该位点在人类、小鼠、鸡、变色龙和酵母的相应蛋白中是高度保守的（图5b）。在随机条件下，这种趋同的替换也是非常罕见的。因此，在这样一个保守的位点置换的重现和固定，表明它很可能对MHS的适应性有益。Hsp90是一种进化上保守的分子伴侣，它能促进多种蛋白质的正确折叠和激活，其中许多蛋白质参与重要的细胞过程，如信号转导、细胞生存和对细胞压力的反应。研究者使用四种MHShsp90异构体进行了同源性建模，分别研究了完整的序列和氨基（N）端区域（代表ATP结合域）。MHShsp90蛋白的特征是在相对保守的基序FYSSX中出现了丙氨酸-丝氨酸突变，预计该突变以短α-螺旋的形式存在。在所有情况下，突变的丝氨酸位于靠近ATP结合口袋的地方，并可能对影响hsp90活性的局部结构相互作用做出重大贡献（图5c）。进一步的结构和伴侣功能研究将阐明这种独特的突变对hsp90蛋白N端区域的结构和功能影响。在所有情况下，突变的丝氨酸都位于ATP结合袋附近，并可能显著促进影响hsp90活性的局部结构相互作用(图5c)。进一步的结构和伴侣功能研究将揭示这一独特突变对hsp90蛋白N-端结构和功能的影响。图5
MHS中蛋白质对静水压力的稳定性增加。结论随着深海潜水和基因组测序技术的发展，研究者在海面下米处发现的一种狮子鱼科物种被发现已经适应了海沟地带的生活，时间仅为数百万年。虽然它的突变率下降了，但其氨基酸取代率很高，允许发生可塑性和适应性。为了适应深海环境的巨大压力和其他挑战，该物种经历了广泛的内部和外部适应。基因组分析显示，分子适应性与耐压软骨一致，视觉功能和皮肤颜色的丧失，增强细胞膜流动性和运输蛋白活性，以及增加蛋白稳定性。在这项研究中发现的大量基因变化揭示了脊椎动物物种是如何在深海中生存和繁荣的。
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