人工核酸内切酶介导的新一代基因组编辑技术

张博，北京大学性命科学学院讲解。年卒业于北京大门生物学系，年获北京大学博士学位，–年在瑞士苏黎世大学从事博士后钻研，随后回到北京大学任教于今。曾做为造访学者赴美国威斯康星大学和加州大学洛杉矶分校停止学术互换。曾获华夏高校科学本领奖一等奖和国度果然科学二等奖。当前以斑马鱼为大势从事细胞增殖分裂与器官产生的遗传与分子机制钻研，同时全力于进展多种遗传学本领。在NatureBiotechnology、PLoSBiology、PNAS等国际学术期刊发布多篇学术论文。

撮要：对基因组特定场所停止针对性妆点的试验法子称为基因组编纂本领。频年浮现的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas等一系列人为核酸内切酶逐步产生了新一代基因组编纂本领，极地面推进了基因组靶向妆点本领的进展，并在基因功效钻研、基因诊疗等周围着手表现庞大影响。文中对这一本领的基根源理、进展始末和应用方法停止了扼要归纳。

遗传学的中央职责之一是阐释基因及其产品的功效，其进展始末了典范遗传学、当代遗传学和功效基因组学等三大要紧阶段。遗传学最要紧的钻研计谋之一为猎取渐变体以及对渐变体停止基因型、表型剖析，除此除外，转基因、RNAi以及其余稀奇性激活或抵制基因抒发的法子也是遗传学钻研中的罕用本领。猎取渐变体的道路重要包含挑选果然渐变体、人为随机诱变(正向遗传学手法)，以及针对基因组上稀奇位点停止靶向妆点(反向遗传学手法)等。此中，也许完结对基因组停止定点诱变的反向遗传学法子是解读基因功效最直接、也是最具备挑战性的手法之一。这一钻研思绪一方面基于对基因组、转录组高通量测序所供应的消息，另一方面则严峻依赖于基因组编纂本领的进展。

在相当长的时间内，绝大普遍生物体或体外教育细胞中不足有用的基因组靶向编纂本领手法，唯一的基于胚胎干细胞和同源重组等多数可行计划存在效率特别低、具备严刻的物种限定性等缺陷，这也在很大水准上限制了功效基因组钻研的始末。跟着DNA测序本领的神速进展，完玉成基因组序列测定的物种数目显现暴发式延长，而基因组定点渐变本领的瓶颈所带来的功效基因组钻研的滞后效应也越首创显。科研办事者紧急需求一种简略、有用的基因打靶本领来解读记录在每一个基因组中的性命的奥妙。近几年，人们高明地行使细菌的一些非凡的基因抒发调控机制，以及多年来对转录因子影响机制的钻研后果，逐步缔造出也许凭借人们的心愿稀奇切割DNA靶序列的人为核酸内切酶(简称EEN)，并借此在理论上完结了对随意物种/基因组的随意位点停止靶向妆点的渴望。该项本领的中央思绪是针对对象位点(基因组上特定的DNA序列)安排并始末基因工程的法子建立特定的核酸内切酶，使其也许稀奇判断、结兼并切割该靶序列，进而在基因组的特定位点产生DNA双链断裂(简称DSB)，终究行使细胞自己的DNA损伤修理的容错性产生靶位点序列产生渐变。当前EEN重要包含锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、规律性成簇分开的短回文反复序列(CRISPR)及干系卵白(Cas)系统(CRISPR/Cas系统)等3品种别。这类基于人为核酸酶的新式基因组编纂本领道理简略、操纵简短，在应用上对物种或细胞没有筛选性，是以快捷成为占有极端普及进展前程和应用代价的热点钻研周围之一。由于该项本领在思绪上不同于保守的以胚胎干细胞为基本的基因打靶计谋，况且在有用性和实用性上均产生了质的奔腾，是以笔者觉得也许借用对新式DNA测序本领的定名，将基于EEN的基因组靶向渐变本领称为“新一代”基因组编纂本领。上面简略归纳、较量EEN以及EEN介导的基因组靶向妆点的类别，并简略预测该项本领的进展前程。

图1三种人为核酸内切酶的根基构造与构成

1人为核酸内切酶的类别与较量

1.1ZFN

ZFN是3种人为核酸内切酶中最先被开拓并投入应用的。人们很早就相识到，生物体中存在多种锌指卵白(ZFP)，它们的共通特征是包含数目不等(时常为3–7)的锌指基序，这些锌指也许介导卵白质与核酸、小分子或其余卵白质的稀奇彼此影响。相当一部份ZFP也许稀奇判断并聚集基因组DNA上特定长度序列的靶位点，进而做为转录因子对基因抒发停止调控。ZFN本领即行使了这一特征。始末人为改革锌指序列(罕用的是C2H2类别的锌指)中对判断并聚集DNA靶位点产生要紧影响的几个关键场所的氨基酸残基，始末基因工程的法子组装出判断特定靶位点的ZFP构造域，并和一个也许非稀奇切割DNA的核酸酶构造域(产生DNA单链或双链断裂)合并，便可取得有或者稀奇切割靶位点的ZFN。时常筛选的切割构造域来自FokI核酸内切酶，它需求在靶序列的下游以二聚化的大势行使切割DNA的功效。是以，在详细应用中，时常需求建立一双ZFN单体，团结应用。每个ZFN含有3个锌指单位，可判断9bp的靶序列(每个锌指单位大体判断3个碱基)。两个靶序列离别位于DNA上相悖的两条链上，并相距特定的分开(图1A)。年，首部分工合成的ZFN被胜利报导可在体外完结对靶序列的切割。年，ZFN初度胜利应用于个人水准，在果蝇中完结了基因的定点渐变。随后数年，这一本领的应用限定被扩展到多种生物体和教育细胞中，进而为良多大势生物首创了反向遗传学钻研的新乾坤。

可惜的是，ZFN本领在现实应用中存在良多题目。首先，关于ZFP与DNA的判断与聚集规律人们相识得并不透澈。人为建立的ZFN和ZFP时常由多个锌指组装而成，然则每个锌指对其靶序列的判断与聚集的本事和稀奇性受高低文(周边的锌指单位)的影响特别大，况且相邻的锌指之间存在着交叉影响。始末量年钻研，人们关于ZFN与其DNA靶序列的彼此影响仅相识到特别有限的一些关连性，譬喻富含G的靶序列更简略取得有用的ZFN等，因此无奈直接凭借所需求识其余靶序列建立响应的ZFN。是以，为了猎取一双也许有用办事的ZFN，常常需求测试或挑选数目特别可观的锌指序列组合库，不单需求耗费相当大的人力物力，况且终究的胜利率也不高。同时，ZFN的诱变效率完全而言较量低(在生物体中良多时间不高出10%。别的，ZFN还存在较高的脱靶效应，即除了切割指定的靶位点，往交易会切割基因组上此外具备相同序列的位点。人们试验过量种法子改良ZFN的稀奇性，譬喻，始末渐变FokI上特定的氨基酸残基获良多种FokI变体，此中有些FokI变体惟独产生异源二聚体时本领构成有活性的内切酶复合体，云云就也许部份节减脱靶效应。然则，整体而言ZFN的稀奇性仍旧不高。上述这些限定性无疑大大补充了ZFN应用的难度。不少钻研组开拓了各类ZFP/ZFN的建立与挑选计划，以期也许处理这些题目。但整体而言，这一本领的应用门坎相当高，个别惟独多数贸易公司才有必定的把握挑选出具备必定靶点判断与切割效率的锌指组合及其ZFN。正在众人计无所出之际，TALEN和CRISPR/Cas系统接踵“突如其来”，这才真实掀起了基因组编纂本领的一场革新。

1.2TALEN

TALEN的基根源理和ZFN相同，也是由稀奇判断靶序列的DNA聚集构造域和FokI切割构造域合并而成，不过由稀奇性较强的TALE构造域取代了ZFP。TALEN的DNA聚集构造域来自于Xanthomonas属植物病原菌抒发的一品种转录激活因子(TALE)。TALE包含多个(时常为12-35)串连的反复单位(称为TALErepeat)，各个单位的长度(时常为33-35个氨基酸残基)和序列骨架特别相同，仅第12位和第13位的两个氨基酸残基存在着高度可变性，称为反复可变双残基(简称RVD)。年，始末统计剖析和试验测试，两个钻研组同时揭露了TALE反复单位的生物学功效——每个单位对应判断靶基因上的一个DNA碱基，是一种崭新的DNA聚集构造域。别的，在判断并聚集靶位点方面，TALE反复单位彼此之间根基没有影响，况且整个也许判断4种碱基的单位都已发掘。只是1年后，人们就表明由TALE和FokI合并取得的TALEN也许对靶位点停止稀奇切割与高效渐变(图1B)。TALE反复单位与靶位点这类详细的逐个双应瓜葛极慷慨便了钻研者的应用，进而罢职了ZFN应用中大范围的挑选办事。TALEN对靶位点序列的请求也特别宽松，仅需求在靶序列5端上游的第一个碱基为T便可。同时，TALEN的切割与诱变效率尽管也存在难以推断况且偶然改动较大等题目，但均匀而言干系于ZFN要高良多。针对不同的位点，TALEN的活性/渐变效率差别也许很大，在生物体中从无活性到渐变效率濒临%都有或者。譬喻，在斑马鱼中，有快要3/4的位点TALEN的渐变效率可达1%以上，有1/4的位点的效率可高于50%(本试验室未发布数据)。别的，当前的钻研后果显示，TALEN的稀奇性特别好，脱靶效应要比ZFN低良多(有或者与其判断地区长度很长干系)。这些特征使得TALEN本领快捷进展起来，在良多周围代替了ZFN的应用。

TALEN本领应用的难点是TALEN抒发载体的建立。TALE构造域较量大，可达–个氨基酸残基(1–bp编码序列)，况且序列高度反复，难以应用通例的PCR、酶切相连平分子克隆本领完结。多个钻研组应用不同的思绪和对象，开拓了各类建立TALE和TALEN卵白抒发载体的法子，进而使得这一本领也许为更多的人应用。

1.3CRISPR/Cas系统

与ZFN和TALEN不同，CRISPR/Cas并非基于与DNA聚集的转录因子修正而成，而是模仿了多种原核生物和古核生物中果然存在的一套取得性免疫系统。细菌也许拿获侵犯的病毒、质粒等外来核酸序列片断，并将其嵌入到其基因组中一段高度串连反复并带有特定回文构造的地区(CRISPR)。这一地区也许被转录、切割产生具备特定二级构造的小片断RNA(称为CRISPRRNA，crRNA)。若细菌被带有统一序列的外来核酸习染，这些crRNA可在CRISPR干系卵白(Cas)和其余RNA(tracrRNA)的扶助下，以碱基配对的方法稀奇性判断外源侵犯序列，并始末各类不同的影响机制组装产生核酸酶切割复合物，降解侵犯的核酸。行使这一特征，年，始末改革机制钻研得最为领会、构成最为简略的II型CRISPR/Cas系统(仅由一个Cas9卵白、一段人为建立的带有20nt判断序列的crRNA和另一个序列通用的tracrRNA构成)，人们在体外胜利完结对带领有一样的20bp序列的DNA双链靶位点稀奇切割。同时，做家还进一步简化了这个系统，将两个RNA分子始末一段相连序列合二为一，况且去除了不需求的地区，安排出一个长度为nt的RNA分子，称为导游RNA(GuideRNA，gRNA；也有文件称为简略导游RNA，singleguideRNA，sgRNA)，并发掘Cas9-gRNA的组协议样也也许完结对DNA的靶向切割(图1C)。是以，CRISPR/Cas系统又称Cas9/gRNA系统。半年后，两个钻研小组应用人为建立的CRISPR/Cas系统胜利地在包含iPS细胞在内的多种体外教育的人类细胞中完结了对基因组特定位点的切割与诱变，进而首创了这一新本领在活体中的应用。

与ZFN和TALEN相较量，CRISPR/Cas系统不是始末卵白与核酸的彼此影响，而是始末核酸与核酸之间的碱基互补配对影响来判断并聚集靶序列，这使其道理和操纵更为简略。CRISPR/Cas系统请求的靶位点序列准则也仅需求在判断地区的3?端下游的3个碱基为NGG。在现实应用中，关于不同的靶位点，只要改动gRNA，而Cas9卵白则都是不异的，无需从新安排与建立；而负责判断不同靶序列的gRNA的长度则特别短，也许始末量种方法在体外神速合成或神速建立体内抒发系统。因而可知，CRISPR/Cas系统在应用的简短性上具备庞大的上风。别的，还也许建立多个gRNA，与Cas9共通导入生物体或细胞内，云云就有或者完结对多个靶位点的同时切割与渐变。当前来看，CRISPR/Cas系统对靶位点的切割及诱变效率与TALEN大体相当，不过，该系统对靶位点的筛选性仍有待深入钻研。

做为一种最新的基因组靶向诱变本领，CRISPR/Cas系统当前存在的一个最值得

转载请注明：http://www.abuoumao.com/hykz/856.html