使用ImageXpressMicro进行

在以高分辨率，多个波长和z平面范围成像样本时，执行基于图像的高内涵筛选的研究人员面临很大的技术挑战。实验通常需要较长的采集时间，较大的存储能力和较高的计算能力。靶向性图像获取的实施使科学家们能够找到稀缺的目标，特别是当整个孔中分布不均匀时。QuickID靶向性图像获取的工作原理是通过低倍镜成像样品，然后通过快速图像分析过程找到感兴趣的物体或罕见事件，然后在高倍放大下重新采集这些图像。QuickID可以使用所需的波长，z-stacks或时间点自动完成。它由MetaXpress软件执行，可与ImageXpressMicro4和ImageXpressMicroConfocal一起使用。医院的耳毒性研究靶向性成像内耳类器官(“迷你耳朵”)用于研究耳毒性的哺乳动物体外模型已利用内耳细胞系和组织培养。然而，组织培养作为用于使用内耳衍生细胞系或斑马鱼侧线的筛选努力产生的越来越多的潜在耳毒性剂的验证工具具有有限的应用。对于药物治疗，细胞系可能与原代细胞具有不同效应。蒂宾根大学医学中心的一项研究利用体外标准化分析法测定来自Corti祖细胞鼠器官的耳毒性药物筛选，代表“迷你耳朵”。

优势

?缩短图像采集时间

?更快地获取目标图片

?降低成像存储要求

?自动压缩Z-stack

在出生后第0天从Corti器官分离来自已知产生干细胞衍生的耳球的NMRI小鼠的细胞。用表皮生长因子(EGF)在体外培养原代细胞(DIV)5天。然后将Otospheres涂布在96孔板上，用γ-分泌酶进行14DIV分化，以获得分化的上皮岛。这些“迷你耳朵”用新霉素等耳毒性药物治疗DIV，然后固定并用DAPI(细胞核)，肌球蛋白VIIa(毛细胞样细胞)，Sox2(支持细胞样细胞)和EdU(增殖细胞)染色。

成像和分析

使用靶向性图像获取工作流程在ImageXpressMicro系统上对“迷你耳朵“进行成像(图2)。首先，使用4x物镜，在单个焦平面中并且仅在DAPI通道中获取具有10％重叠的2x2位点的图像阵列。对于整个96孔板，这种快速采集仅需约4分钟。然后，拼接2x2孔位点并通过MetaXpress鉴定“MiniEars”的XY平板坐标(1％假阴性检测率;7-25％假阳性检测率)。然后在第二次采集运行中对这些位置进行成像，其中20x物镜具有四种颜色(DAPI，FITC，TRED和Cy5)，范围为24μm(2μm间隔)。MetaXpress允许在采集期间自动压缩Zstack到最大强度图像。为了减少存储空间和分析时间，仅保存了Z-stack的最大强度投影。每个孔平均出现10个“迷你耳朵”，靶向性图像重新获取的速度比采集84个位点的整个孔快8倍(图4)。此外，存储要求和分析时间可减少八倍以上。MetaXpress软件的自定义模块编辑器用于构建用于识别和计数“迷你耳朵”的分析工作流程、个体生物标志物的鉴定、以及染色强度、面积和分布的测量(图)。使用MetaXpressPowerCore分布式分析解决方案以高通量进行整个板的分析。

用耳毒性氨基糖苷类新霉素处理“迷你耳朵”诱导毛细胞样细胞的损失(EC50≈1μm)，如图5所见MyosinVIIa阳性细胞与DAPI阳性细胞的比率降低。?5个耳蜗产生个耳球，分化成个“迷你耳朵”?7％的otosphere到“迷你耳朵”转换率?70％的“迷你耳朵”为Sox2阳性，0％为MyosinVIIa阳性，29％两者皆有。

通过共聚焦成像提高分辨率

使用ImageXpressMicroConfocal系统的60μm针孔共聚焦模式实现了改善的图像质量和物体分辨率(图6)。观察到细胞轮廓更清晰，z平面之间的串扰更少，从而在图像分析期间产生更好的物体分割

靶向性图像获取可以大大减少采集时间，图像存储要求和分析时间。这种“迷你耳朵”应用展示了一种强大的筛选试验，用于进行体外高内涵的耳毒性筛查。扩展测定以包括额外的生物标志物，报道小鼠品系和人iPS细胞将进一步增加数据集的相关性。

致谢

本应用简报中提供的医院蒂宾根听力研究中心MirkoJaumann博士提供。

参考文献

Oshima,K.etal.Differentialdistributionofstemcellsintheauditoryandvestibularorgansoftheinnerear.JARO8,18-1,().

2.Mizutari,K.etal.Notchinhibitioninducescochlearhaircellregenerationandrecoveryofhearingafteracoustictrauma.Neuron77,58-69,(）.

纺锤体有丝分裂

在正常细胞群中，仅约1-5％的细胞处于有丝分裂中。有针对性的采集可用于识别整个群体中的这些细胞，然后在高倍镜下随时间变化跟踪它们。如果单个细胞在采集时间过程中移出区域，则可以对单个细胞进行跟踪和重新定中心。

D微球

微球体通常积聚在平底板的边缘。可以执行初始透射光采集，然后进行荧光标记物的z-stack靶向性图像获取，以大大减少所需图像的数量.

脑切片中的海马

根据样本形态及其制备，海马和大脑的其他部分可能会在切片的各个区域结束。可以在多个波长下执行z-stack靶向性图像获取以用于共定位的研究

斑马鱼心跳

斑马鱼在井中的位置和方向可以变化。可以使用靶向采集来执行心脏，眼睛，脑，卵黄囊，虹膜细胞或血管的高倍镜z-stack或延时采集。

微核

在低倍镜下，难以准确地确定物体是否真的是微核或仅仅是人工制品。在高放大倍率下进行有针对性的重新采集有助于减少误报的数量。

转载请注明：http://www.abuoumao.com/hytd/7816.html