国际研究丨斑马鱼的骨骼生物学研究

文丨KristinDietrich,ImkeAKFiedler,AnastasiaKurzyukova,AlejandraCLópez-Delgado,LucyMMcGowan,KarinaGeurtzen,ChrissyLHammond,Bj?rnBusse,andFranziskaKnopf

翻译丨郭胜亚

发表于《JournalofBoneandMineralResearch》,Vol.36,No.3,March,pp–.

核心摘要：斑马鱼是硬骨鱼(bonyfish)，与哺乳动物有共同的祖先，属于骨鱼门，它们的骨骼系统继承自骨鱼门。事实上，硬骨动物和哺乳动物在骨骼元素、骨化机制和骨基质成分方面有许多共同的遗传保守特征。

然而，在骨骼研究中对斑马鱼进行研究时，需要考虑与骨形态和功能相关的差异。本文就斑马鱼的骨骼结构、脊柱形态及相关解剖结构进行综述。我们概述了斑马鱼不同的骨化类型和骨细胞，并在显微组织水平描述骨基质组成，重点评估矿化。正如我们在这里所阐述的，骨骼形成的过程也强烈地依赖于斑马鱼的负重。

一、斑马鱼概述

在基础和临床前研究中，斑马鱼已成为研究骨骼发育和疾病的重要模式生物。这些硬骨鱼的潜力在于它们的小体型，容易照顾，遗传顺从，和高再生能力。此外，由于胚胎和幼虫阶段的透明性，利用影响特定细胞或组织的转基因和突变株，可以更详细地监测骨生成和成骨细胞的活性。这与胚胎、幼虫和成年个体长期体内成像的可行性相结合，从而将斑马鱼与其他脊椎动物模型(如啮齿动物)区分开来，在啮齿动物模型中，体内成像具有挑战性(表1)。重要的是,斑马鱼的基因组包含约82%的人类疾病相关基因的同源基因，包括那些影响骨骼的基因。通过位点特异性重组酶(Cre)的组织特异性过表达和通过聚类规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas9的基因特异性敲除，以及反义寡核苷酸基因敲除方法在斑马鱼中都是可行的，这是进行正向和反向遗传筛选的理想条件。此外，单核苷酸基因组编辑可以通过CRISPR-Cas9介导的敲除蛋白完成。最后，药物可以通过多种方式给斑马鱼用药，包括直接将化学物质溶解在斑马鱼水/培养基中，这是药物筛选的首选方法(如下图表1)。以上描述说明了斑马鱼研究骨骼生物学和疾病的潜力。斑马鱼作为骨骼研究模型的各个方面都得到了很好的评价。在这里，我们旨在通过介绍斑马鱼的骨骼结构和模式、细胞类型和基质矿化(依赖于负载)的基本信息，将斑马鱼介绍给更广泛的骨骼研究群体。二、斑马鱼骨架的结构

图1所示斑马鱼的骨架。(A)颅面和轴向骨骼的μCT图像，包括由韦伯式的设备组成的脊柱、腹部(也称为前尾或胸)、尾、尾鳍椎骨。Hox基因表达模式显示。与哺乳动物骨骼相似，斑马鱼的肋骨与腹椎骨相连，保护内脏器官。(B)腹部和尾椎的近景。两个相邻的双锥形椎体(左)矢状面显示神经弓向背侧延伸并包围神经根。从腹椎骨向腹侧延伸的肋骨是铰接的，而尾椎骨延伸到包围尾动脉和静脉的血管弓。正面图(右)显示未矿化的椎体中心，包含脊索和空泡性软组织(未显示)。环状椎体终板区域由IVL连接(图中未显示)，与斑马鱼的椎体生长区相对应。参数，包括VBL,V.Th和BV/TV，提供了有价值的措施来量化椎体的形态和结构。BV/TV=骨体积分数;IVL=椎间韧带;VBL=椎体长度;V.Th=椎厚度。

脊椎动物的骨骼一般分为外骨骼和内骨骼。斑马鱼骨骼的突出部分如下:(i)颅面骨骼，包括顶骨、颌骨和盖鳃的骨;(ii)轴向骨骼包括脊柱、肋骨、肌间骨以及非成对的背鳍、肛鳍和尾鳍(图1A).。斑马鱼的性成熟时间为90天，相应的标准长度(SL;从吻部到成年个体的最后尾椎)为1.5到2.0厘米。斑马鱼不断生长，骨骼体积不断增大，体长可达3至4厘米，通常寿命为3年左右(也可达到5年)。

成年斑马鱼的头盖骨由74块颅面骨组成，远远多于哺乳动物的22块头骨。然而，斑马鱼的许多骨骼结构在哺乳动物中有明显的同源性，包括神经颅的前部，它类似于哺乳动物的上颚，以及在斑马鱼和哺乳动物之间保留的颅穹窿。和哺乳动物一样，斑马鱼头骨的特征是骨骼关节，包括纤维关节(如颅骨缝合)和下颌关节。

在脊柱形态方面，斑马鱼的椎骨数量与人类相似(斑马鱼为30-32节，人类为33节)，生理曲度与人类相似:肋骨保护内脏的腹部区域脊柱后凸，尾端前凸。在颅尾目中，斑马鱼的脊椎由韦伯式的四节椎骨组成，连接着鱼鳔和耳朵(对声音的传递很重要)，10个腹椎骨(也称为尾前椎骨或躯干椎骨)由杆状肋骨节连接，过渡到14个尾椎和3个尾鳍椎骨。与哺乳动物的椎管相似，脊髓通过从每个脊椎骨向背侧延伸的神经弓。尾椎也有向腹侧伸展并包围尾动脉和尾静脉的血管弓。

斑马鱼个体椎体中心的三维形态特征为其沙漏形状(图1B)与含有小梁骨和携带骨髓(BM)的哺乳动物脊椎骨不同，斑马鱼的脊椎体不容纳红色的BM，因为成年斑马鱼造血发生在肾脏(表1)。相反，它们充满了空泡状的脊索细胞，并被脂肪组织包围。在个体椎骨狭窄的中心周围发现了微米薄的小梁支撑。

虽然评估脊椎小梁骨(一种检测哺乳动物骨骼脆性的方法)在斑马鱼中是有限的，但椎体中心的形态通常被用作衡量脊椎骨骼质量的指标。3D的形态学参数,如椎体长度(VBL),骨体积(BV)、骨体积/组织体积(BV/TV),椎横断面厚度(V.Th)和偏心率(圆度)提取微计算机断层扫描(μCT)扫描的斑马鱼脊柱(图1B),允许定量的变化，例如，由于肌肉骨骼活动改变，衰老和疾病。

此外，血管弓和神经弓的厚度和体积用于评估斑马鱼突变体的椎体形态。小型斑马鱼的一个优点是可以在高分辨率下分析完整的骨骼(例如，全身的μCT扫描，像素大小为1μm2)，比在大型啮齿动物物种中更快。这提供了一种可能性，既可以评估整个机体的整体三维形态，又可以同时在高分辨率下表征组织形态，这已在变形的骨关节炎椎体中完成。此外，纵向组织学切片或整片染色，如茜素红染色，可以在显微镜分辨率下显示完整的骨骼。

图2所示斑马鱼骨基质成分的评估。(A)拉曼光谱可以绘制再生尾鳍骨(此处为7dpa处的矿物与基质比率)近端和远端截肢平面(箭头)的矿物相关和蛋白质相关特性。再生部位的拉曼光谱(灰色曲线),蛋白质相关的峰包括酰胺I、酰胺III和羟脯氨酸，与矿物相关的磷酸盐峰相比更显著，反映出与天然骨组织相比更低的矿物-基质比率(黑色曲线)。(B)qBEI可用于评估斑马鱼骨骼中的矿物密度分布(此处为脊柱矢状面和终板区域特写)。由感兴趣区域内的校准像素强度生成的直方图允许提取Camean、Capeak和Cawidth，以及具有Calow和Cahigh的区域。Cahigh=高矿化程度;Calow=低矿化程度;Camean=Ca均值含量;Capeak=Ca峰含量;Cawidth=Ca分布的异质性;dpa=截肢后天数;qBEI=定量背散射电子显微镜。

和哺乳动物一样，斑马鱼的脊椎是由软组织连接在一起的，这有利于运动，也增加了运动的范围。在哺乳动物中，椎间盘(IVD)由纤维软骨软骨(纤维环)和髓核组成。相比之下，斑马鱼的椎间软组织的特征是环状韧带(椎间韧带[IVL])连接相邻两个椎体的最外层圆形边缘。虽然IVD在人体中的生理作用是阻尼重力载荷的压缩力，但斑马鱼的脊柱是轴向加载的，这是由于在粘性的水中游泳产生的压缩力和附着在椎骨上的肌腱直接传递的肌肉力。与重力垂直作用于脊柱的四足动物(如老鼠、狗)相比，斑马鱼在负重方面更具优势。因此，它们为研究脊柱和椎间组织退行性变以及运动模式改变对骨-肌腱-肌肉单元的影响提供了一种有价值的工具，这可以通过组织学和先进的x线成像方法在小型斑马鱼中进行评估(图2)。

三、斑马鱼轴向和鳍骨架的图案

和其他脊椎动物一样，斑马鱼骨骼的轴向模式表现在脊柱上，脊柱沿着前后轴被划分为不同类型的脊椎。对小鼠和鸡的研究揭示了不同类型脊椎的形态多样性和轴向位置，这些脊椎对区域Hox基因表达编码的位置线索敏感。虽然人类中的HOX突变导致早期发育致死，但已经描述了与HOX相关的轴向骨骼缺陷，以及四肢和颅面缺陷、关节炎和各种类型的癌症。斑马鱼轴向骨骼的分区受到相同的机械控制，依赖于空间(和时间)共线性;即染色体上基因的物理序列与其表达前后边界(和时间)之间的对应关系(图1A)。哺乳动物基因组中有39个Hox基因分布在4个集群中，而斑马鱼有48个基因分布在7个集群中。这些差异是脊椎动物进化过程中基因组复制和基因丢失的结果。因此，Hox表达域和轴向结构区划性在斑马鱼和四足动物之间只有部分相同(如Hoxc6和Hoxd12，但Hox9不相同)。然而，研究胚胎和幼体斑马鱼的同源性转化可能是揭示Hox蛋白多种调节功能的有用工具。

图3所示四肢和胸鳍芽的早期模式是相似的。(A-C)斑马鱼鳍芽的早期模式。(A)在12hpf时的鳍诱导:来自孢子虫的RA激活信号，导致侧板tbx5和远端芽Fgf信号的激活，建立AER。(B)Hox基因和shh在30hpf的早期表达。(C)Hox基因和shh在60hpf的表达。需要注意的是，在30hpf和60hpf处，后翅芽区的hoxd11表达域仍然局限于该区域。虚线=在芽适当和鳍折边界。(D)类似于A中描述的鳍芽诱导信号在小鼠E9位点出现。(E)Hox基因和shh在E10.5小鼠肢体中的早期表达与在鳍芽中的B中观察到的模式相似。hoxd9和hoxd10贯穿整个花蕾，而hoxd11、hoxd12、hoxd13和shh则局限于后端区域。(F)E12.5小鼠四肢Hox表达域与鳍芽C中Hox表达域的差异;hoxd11、hoxd12和hoxd13域向更前面延伸;嘘的声音仅限于臀部。从左到右=近端远端轴，从上到下=前后轴。E10.5=胚胎期10.5天;E12.5=胚胎期12.5天;E9=胚胎第9天;hpf=受精后小时数。

在鱼类中，轴向骨骼包括脊柱和相关的中鳍(背、肛和尾)，而成对的胸鳍和骨盆鳍位于腹部区域的腹外侧。斑马鱼的背鳍和臀鳍的位置尚未被研究过，但推测可能与鲨鱼一样，是由Hox和Tbx基因的表达域决定的。在Hox表达和维甲酸(RA)等诱导信号方面，胸鳍的发育与四足动物四肢的发育表现出高度的相似性，特别是在早期阶段(图3A-F)。在原肠形成过程中，RA负责边缘区定位。随后，RA在体节中产生并激活中间中胚层的Wnt2b，而Wnt2b又激活侧板中胚层的Tbx5。Tbx5是前肢启动过程中最早的转录因子，然后触发成纤维细胞生长因子(Fgf)信号，建立转录级联，调节肢体近端和远端模式。在四足动物和鱼,两个信号附体的组织者在原基形成:顶端外胚层的脊(AER)远端芽,调节肢体和鳍产物通过Fgf信号和极化区活动(ZPA),后声波刺猬的表达(嘘)和调节前后的模式，非脊外表皮指示背腹模式。虽然这些机制显然是保守的，但鳍和肢在后期的调控和模式差异表明，表达模式和信号机制在进化过程中已经被修改，即在鳍到肢的过渡过程中，这可能导致了新骨骼特征的产生，比如四足动物的趾。在四足动物和鱼类(包括斑马鱼)中对Hox基因表达和调控这些和其他模式决定因素进行对比，将在未来揭示骨骼进化和人类先天模式缺陷的更多方面。

四、骨化类型和骨细胞

在斑马鱼中，受精后3—4天，骨骼开始发育，并在2-4个月时逐渐形成成熟的骨骼(取决于斑马鱼的大小，表1)。许多元素通过膜内和软软骨骨化形成，还有一些元素通过软骨内骨化形成(表1)。斑马鱼骨骼根据解剖区域的不同，是由三种骨化类型中的一种形成的。膜内骨化是斑马鱼骨骼骨化的主要形式，主要发生在颅顶、覆盖鳃的鳃盖和大部分椎骨等部位。软骨内骨化，即软骨模板依次被骨取代，只产生包括1至5椎体神经弓在内的少数元素。软软骨骨化发生在软骨表面而不取代软骨模板，发生在斑马鱼下颚。虽然哺乳动物的椎骨完全通过软骨中间形成，但斑马鱼中心直接矿化从脊索鞘，脊索周围的骨化层，然后膜内骨形成。值得注意的是，脊索鞘也负责在中央形成之前斑马鱼脊柱的分割。基于脊椎动物骨骼基因的进化保守性，斑马鱼骨骼中含有与哺乳动物相同的骨细胞，即成骨细胞、破骨细胞和骨细胞(表1)。与哺乳动物一样，骨结合是由骨祖细胞衍生的成骨细胞完成的。在斑马鱼骨骼中，骨表面有很大一部分被成骨细胞覆盖，成骨细胞的形态变化很大，并依赖于其位置和功能。在脊柱中，成骨细胞骨形成导致椎体前后方向体积和长度增加，从而拉长脊柱。在椎体间生长区域，特别是在圆形椎体终板上，可以很容易地评估这种骨形成(图1B)。通过使用静态组织形态测定法(静态组织形态测定法通常应用于啮齿动物骨骼或人体活检)，可以分析斑马鱼脊柱中的骨骼，包括每骨周长成骨细胞数量(N.Ob/B.Pm)、每骨表面类骨质表面(OS/BS)和类骨质厚度(O.Th)。然而，斑马鱼骨也可以在连续的时间点用钙黄素或素红等荧光染料标记，提供了进行动态组织学形态测定的机会，并确定骨形成率(BFR)和骨矿物附着率(MAR)(表1)。在啮齿类动物或人类模型中，染料是通过注射或摄入来使用的，而斑马鱼通常是通过将它们浸泡在染料溶液中来染色的。斑马鱼的骨吸收是由单核和多核破骨细胞完成的。尽管单核破骨细胞存在于发育的早期阶段，并且与浅层骨吸收模式有关，但多核破骨细胞会产生骨吸收陷窝，这在哺乳动物后来的破骨细胞中很常见。哺乳动物骨骼建模和重塑的概念也适用于斑马鱼。骨造型被定义为通过骨形成和骨吸收来适应不同表面载荷增加或减少的过程，而重塑则是在同一位置进行，以维持骨基质质量和修复微裂纹。重塑，包括机械敏感骨细胞对破骨细胞和成骨细胞的协调，以更新骨和修复微裂纹，在斑马鱼中不太明显。骨基本上不存在。然而，斑马鱼的重塑过程被认为是位点依赖性的，并与终生生长的需求有关。斑马鱼的骨头，与medakfish(Oryziaslatipes，另一种硬骨鱼)的骨头相反，通常是骨细胞性的，尽管脊椎骨在幼年早期不包含骨细胞，而骨鳍射线和鳞片在整个生命过程中都保持骨细胞性。尽管哺乳动物骨细胞是重塑的主要协调者，但只有少数研究

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