斑马鱼行为篇斑马鱼在AD研究中的应用前

AD是诱发进行性痴呆的主要原因之一，属于神经退行性疾病（NDD）。其主要病理改变为β-淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursorprotein，APP)异常代谢而导致β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)合成异常、代谢水平降低和转运失衡，形成老年斑以及Tau蛋白过磷酸化形成神经原纤维缠结和神经元的丢失。现临床上用以治疗AD的药物主要包括乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂等。年龄增长、遗传、环境污染等因素也是诱发AD的主要原因。目前，与AD发病机制相关的假说主要包括Aβ级联假说、Tau蛋白假说、胆碱能假说、神经免疫炎症、线粒体功能障碍等。与AD小鼠模型相比，斑马鱼AD模型同样表现出Aβ的沉积及行为学的改变，同时其造模时间短、成本低，可作为AD小鼠模型的替代模型之一。

一、Aβ诱导的斑马鱼AD模型

当脑内Aβ的生成率高于清除率时，过多Aβ在脑内沉积，从而诱发神经毒性。同时，Aβ还能造成线粒体产能障碍，引起线粒体自噬、突触丢失和细胞死亡，进而加快AD的进程。Aβ诱导AD模型一般通过在实验动物脑内海马体、侧脑室等部位注入Aβ片段获得。有相关研究表明，向雄性昆明种小鼠双侧海马体注射Aβ1-42后，通过免疫组化和Westernblotting试验可见模型组小鼠海马IL-1β、IL-6、p-p38的表达均有所上升；在向雌性Wistar大鼠双侧海马体注射聚集态Aβ25-35后，通过q-PCR和Westernblotting试验可见模型组大鼠脑内海马组织Bcl-2的表达下降而Bax和Caspase-3的表达上升，说明向实验动物脑内注入Aβ片段的造模方式是可行的。但截至目前，斑马鱼内源性Aβ还未被发现，其体内APP的处理过程是否与人类相似尚不明确。现多将Aβ直接加入斑马鱼幼鱼的养殖水中进行造模，或将斑马鱼麻醉后直接向侧脑室注射Aβ蛋白。

二、氯化铝诱导的斑马鱼AD模型

铝是参与并导致严重NDD的神经毒性元素之一，有研究表明，铝的聚集部位在脑，且铝暴露也被认为是引发AD的主要原因之一。在AD患者的大脑中可以发现其铝含量显著增高，但目前尚不清楚这是AD的病因还是因AD的发生而对大脑产生的影响。高浓度的铝对水生动物，尤其是用鳃呼吸的鱼类具有极大的毒性，可通过破坏血浆和血淋巴离子造成渗透压调节异常，引发与AD患者神经退行性病变相似的症状。但也有推测，金属暴露所引发的AD可能与患者的年龄增长有着更直接的关系，而并非单一金属摄入导致。有研究发现，用氯化铝浸泡斑马鱼96h可表现出明显的AD样行为。也有实验用结晶氯化铝配制成μg·mL–1的染毒液，持续浸泡斑马鱼30d，每日更换一半染毒液，可见斑马鱼端脑神经细胞数量明显减少；脑组织Aβ生成相关appb、bace1、aph1基因表达明显增高。还有研究发现，AD的发生还可能与铁、铜、锌等其他常见金属元素相关，过量摄入某些金属元素可能导致Aβ在脑内的堆积或使胆碱能系统受损，进而引发AD。氯化铝诱导的斑马鱼AD模型制作过程便捷、价格实惠，目前使用较为广泛。

三、冈田酸(okadaicacid，OA)诱导的斑马鱼AD模型

OA是分布最广泛的海洋毒素之一，极易在贝类和部分鱼类中积累，被人类食用后引起食物中毒。OA本身是多种丝氨酸/苏氨酸磷酸酯酶抑制剂，使用后可引起全身磷酸酯酶的升高，使磷Tau蛋白在脑内大量堆积，常用于制作体外Tau蛋白过磷酸化的AD模型。有研究将12~15月龄的斑马鱼在nmol·L–1OA的养鱼水中持续暴露9d进行造模；也有采用0.20μmol·L–1的OA处理3dpf斑马鱼幼鱼7d，得到的斑马鱼AD模型存在明显的神经行为功能障碍。虽用OA诱导斑马鱼AD模型操作便捷且较为有效，但OA价格较高。

四、转基因斑马鱼AD模型

目前确定的AD相关基因有APP基因、早老素1(presenilin-1，PSEN-1)基因、早老素2(presenilin-2，PSEN-2)基因等，其致病的主要机制为影响APP的正常切割而导致患者脑内Aβ1-42的堆积。常见的用以制作AD转基因动物模型的方式主要为基于上述基因的双基因和多基因突变，这在啮齿类动物模型上尤为显著，但目前已知的斑马鱼AD转基因模型大多仅对单一基因进行突变。

五、PSEN1转基因斑马鱼AD模型

PSEN1被认为是一个家族性AD相关的基因，该基因的突变会影响γ-分泌酶对APP的切割和Aβ的产生，进而参与AD的进程。有实验采用删除2个密码子的方式导致斑马鱼PSEN1基因突变，诱导斑马鱼早发性家族性AD病变模型，可见斑马鱼脑中出现ATP合成障碍及溶酶体功能紊乱。

六、PSEN2转基因斑马鱼AD模型

PSEN2也是目前已知的导致家族性AD的致病基因之一，但该基因的突变概率较低，目前相关研究也较少。有研究利用MO抑制斑马鱼胚胎PSEN2基因制作AD模型，可见γ-分泌酶活性降低及严重的发育缺陷和神经元丢失，并通过p53途径诱导细胞凋亡。也有研究利用同样的方法制作了相关模型，发现PSEN2活性的降低会明显减弱斑马鱼胚胎的Notch信号并导致神经发育紊乱。

七、APP转基因斑马鱼AD模型

斑马鱼有2个APP的同源基因，分别为APPa和APPb。斑马鱼APPa类似于人类APP亚型，是人类APP的直系同源物，与aplp2一样都是Aβ前体蛋白家族成员；而APPb类似于人类APP亚型，敲除该基因后可导致家族性AD，不仅可能参与AD的发病机制，且可能影响AD前的发育。有实验通过向斑马鱼插入人APP瑞典型突变基因(APPsw)制作斑马鱼AD模型，在12月龄时可见线粒体缺失、神经元数量减少、Aβ沉积等病理现象。有研究AT-tau的转基因斑马鱼模型，可见明显的发育障碍和运动缺陷；还有研究发现UCP2、Δp53等基因也可影响AD的发病进程。目前，使用较多的仍为AD相关的双转基因或多转基因小鼠模型。

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