烟酰胺核苷酸转氢酶独特色素沉着机制

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■黑色素合成与“晒黑”的经典途径

黑色素合成：黑色素合成发生在黑色素细胞中的黑素体中，可分为2个阶段

第一阶段：酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下生成L-二羟基苯丙氨酸多巴(L-DOPA)，并在酪氨酸酶作用下进一步生成多巴醌(DQ)。

第二阶段：有半胱氨酸或谷胱甘肽(Cys/GSH)存在时，DQ与其反应生成半胱氨酰多巴或谷胱甘肽多巴，进而被氧化聚合生成褐黑素(可溶性聚合物，易代谢)；当它们不存在时，在酪氨酸酶或TYRP1等氧化酶的作用下，形成DHI和DHICA黑色素。这2种黑色素，不易代谢，俗称“真黑素”。

图1.黑色素合成途径与经典“晒黑途径”a:黑色素合成涉及酪氨酸酶基因家族中的3种酶，即酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2);b:cAMP-MITF-色素沉着途径

“晒黑”的经典途径：紫外线照射导致角质形成细胞中的DNA损伤和p53活化，p53激活POMC，POMC前蛋白裂解形成的α-MSH。α-MSH与黑素细胞膜中的MC1R结合，导致cAMP增加和PKA激活。活性的PKA使小眼相关的转录因子(MITF)增加，MITF转录进而调节色素沉着酶，如TYRP1、TRP2和酪氨酸酶等。

■Cell高分阐述皮肤色素沉着的新机制

在今年7月6日，Cell在线发表了“NNTmediatesredox-dependentpigmentationviaaUVB-andMITF-independentmechanism”。这篇文章阐述了一种皮肤色素沉着的新机制，参与调节这一过程的主要为烟酰胺核苷酸转氢酶(NNT)，NNT消耗调节细胞内氧化还原水平变化，影响酪氨酸酶降解，还参与调节真黑色素水平和色素沉着。

图2.研究思路

■NNT敲低导致黑色素含量增加

在黑色素瘤细胞系UACC中，siRNA敲低NNT表达会导致黑色素含量的增加(图3a)。与此同时，siNNT后色素沉着的增加被酪氨酸酶的敲低阻断(图3b)，这表明siNNT介导的色素沉着对酪氨酸酶的依赖性。

由于NNT可以通过控制NADPH转化来调节线粒体氧化还原水平，假设NNT沉默后色素沉着的增加是由氧化应激依赖性机制驱动的。实验结果表明，NNT的敲低导致UACC细胞中NADP/NADPH比率的显着增加，且诱导细胞溶质ROS增加(图3c)。而如图3d-e所示，抗氧化剂NAC和MitoTEMPO会抑制siNNT介导的色素沉着增加。这些结果表明，NNT通过依赖氧化还原的机制影响色素沉着。

图3.NNT敲低导致黑色素含量增加a:siNNT增加UACC细胞的色素沉着;b:酪氨酸酶敲低对siNNT色素沉着的影响;c:siNNT处理后UACC细胞中的ROS的变化;d-e:NAC或MitoTEMPO处理siNNT诱导的人UACC黑色素瘤细胞

■NNT消耗增强色素沉着，独立于经典的cAMP-MITF-色素沉着途径

紧接着，作者开始探究NNT敲低后色素沉着的机制。首先研究了NNT敲低对UACC细胞中关键黑色素生物合成因子的影响：siNNT使得黑色素生物合成酶酪氨酸酶、TYRP1和TRP2/DCT的水平显着增加(图4a)，但对MITF蛋白和mRNA水平均没有太大影响(图4b)。

经典cAMP-MITF-色素沉着途径中，cAMP是紫外线诱导皮肤色素沉着的关键信使，然而，如图4c，Forskolin(cAMP激活剂)并不影响原代黑素细胞以及人皮肤组织在UVB照射条件下的NNT表达水平。这些结果表明，NNT依赖性的色素沉着机制独立于cAMP-MITF依赖性色素沉着途径。

图4.NNT介导的色素沉着机制a:siNNT处理72小时后UACC黑色素瘤细胞的酪氨酸酶、DCT/TRP2和TYRP1的表达;b:siRNA转染后NNT、mMITF和TYRP1的qRT-PCR分析;c:Forskolin处理黑色素瘤细胞和皮肤组织

■NNT促进泛素蛋白酶体依赖性酪氨酸酶降解并调节黑素体成熟

改变NNT会影响酪氨酸酶和关键黑色素生成酶的蛋白质水平，假设NNT会影响某些黑素体蛋白质的稳定性。

如图5a显示，siNNT显着增加酪氨酸酶蛋白的稳定性，抗氧化剂(NAC或MitoTEMPO)会下调这种稳定性(绿色框)。MG-是一种蛋白酶体抑制剂，可阻抑NNT过表达诱导的UACC细胞酪氨酸酶蛋白稳定性降低(图5b)。

研究者们还观察了原代人类黑素细胞中，NNT表达对黑素体超微结构的影响。如图5c所示，siNNT导致晚期/色素沉着黑素体(阶段III和IV)的显着增加，而NNT的过表达会导致向早期/无色素黑素体(阶段I和II)的转变(图5d)，这些结果表明NNT通过蛋白酶体介导的酪氨酸酶蛋白降解诱导黑色素水平的变化，并调节黑素体中的成熟。

图5.NNT敲低条件黑素体的成熟a:siNNT介导的增加的蛋白质稳定性被抗氧化剂阻断;b:MG处理过表达NNT的UACC细胞;c-d:黑素体成熟的检测

■NNT调节小鼠、斑马鱼和人类色素沉着障碍的色素沉着

2,3BD是一种NNT的抑制剂，如图6a所示，在人体皮肤模型上，2,3BD可显著诱导黑色素沉积。2,3BD处理还可防止形成UVB诱导的CPD(紫外辐射后的一种光产物)，并且2,3BD还显著下调了γ-H2AX(一种DNA双链断裂的标志物)表达(6b-c，绿色框)。2,3BD诱导的色素沉着可以保护人体皮肤免受UVB诱导的DNA损伤。

研究者们选择了Nnt突变纯合子的C57BL/6J小鼠模型，与C57BL/6NJ野生型相比，如图6c所示,NntC57BL/6J小鼠显示出皮毛色素沉着增加。

此外，如图6d,还构建了斑马鱼NNT过表达模型，过表达NNT的斑马鱼(NNTOE)与空质粒斑马鱼胚胎相比，所观察到黑色素细胞内色素沉着减少，使用2,3BD处理NNTOE鱼阻止了NNT过表达诱导的黑素细胞色素沉着减少。

图6.NNT敲低条件黑素体的成熟a:2,3BD诱导皮肤色素沉积;b:2,3BD处理在UVB诱导条件下的CPD和γ-H2AX的表达变化;c:纯合子nnt敲除鼠色素沉积;d:过表达NNT(NNTOE)的斑马鱼模型

小结：这篇文章阐明了一种新的依赖于NNT的独特色素沉着机制，与经典的UVB-cAMP-MITF晒黑途径不同。

研究者们还用不同肤色的人皮肤组织进行了紫外线辐射，发现具有较深色素的皮肤确实受到了保护，免受紫外线造成的DNA损伤。