tRNAs中糖基化辫苷修饰与功能

十一月辫苷（Queuosine，Q，7-脱氮鸟苷衍生物）是存在于转运RNA（tRNA）反密码子中经过修饰的特殊核苷。在脊椎动物的酪氨酸和天冬氨酸的tRNA中，辫苷被进一步糖基化，形成galQ以及manQ。然而，关于辫苷糖基化的生物发生以及生物功能的相关机制仍然知之甚少。年11月21日，日本东京大学TsutomuSuzuki研究组与TakeoSuzuki研究组合作在Cell上发表了文章GlycosylatedqueuosinesintRNAsoptimizetranslationalrateandpost-embryonicgrowth，通过生物化学方法鉴定了辫苷糖基化酶QTGAL和QTMAN，进一步通过结构生物学揭开了糖基化辫苷调节密码子识别的分子基础，最后通过斑马鱼中qtgal以及qtman敲除发现辫苷糖基化修饰对于脊椎动物胚胎后生长具有非常关键的作用。转运RNA(tRNA)修饰对蛋白质合成至关重要。tRNA上第34位辫苷在核糖体解码过程中保持翻译的准确性和效率非常重要，Q34会被糖基化修饰（图1）。尽管Q34这一位点在生物王国中高度保守，但是其生物合成在细菌和真核生物中是很不同的。首先作者们试图检测糖基化修饰辫苷形成活性，利用重组tRNA作者们检测了galQ和manQ的形成。图1Q34糖基化修饰为了鉴定QTGAL以及QTMAN，作者们对大鼠或者猪肝脏裂解物进行分选，在DEAE层析流动部分检测到QTGAL活性，mMNaCl洗脱部分则检测到QTMAN活性。随后作者们对两种酶进行了纯化，并对重组蛋白Q糖基化修饰的动力学及性能检测。QTMAN催化manQ形成tRNAAsp以及GDP-man的Km分别是78nM以及69nM。之后，作者们想要检测Q糖基化修饰生物学功能以及生理学影响，作者们使用CRISPR-Cas9基因编辑系统在HEKT细胞中敲除了QTGAL以及QTMAN。先前的研究中，作者们构建Q缺乏的HEKT细胞，QTRT1以及QTRT2敲除细胞系，发现QTRT1以及QTRT2对于胞质Q以及糖基化修饰Q的形成。通过Northern杂交，作者们发现QTGAL以及QTMAN敲除导致Q糖基化缺失，但并不会影响tRNA的稳定性。进一步，作者们检测QTGAL以及QTMAN的亚细胞定位，发现QTGAL定位在胞质，QTMAN则定位在胞质和细胞核中。功能方面，Q糖基化对于密码子特异性翻译以及蛋白质稳定性非常关键。为了对Q34以及糖基化修饰的Q34在密码子-反密码子相互作用的结构基础，作者们还进行了单颗粒扫描电镜结构解析，揭示Q糖基化修饰识别基础。为了对辫苷以及对糖基化修饰的活性，作者们以斑马鱼作为模式生物进行了Q糖基化遗传研究。斑马鱼基因组中辫苷生物合成以及修饰酶的同源蛋白每种有一个，分别是qtrt1、qtgal（b3gntl1）以及qtman（gtdc1）。这三种基因mRNA水平在受精卵中水平由母源性保持稳定，在受精后逐渐降低。之后，作者们使用CRISPR-Cas9系统构建了qtrt1、qtgal以及qtman的突变体，引入的突变会造成移码并产生无活性的蛋白。这三个突变体都能够存活，并且繁殖能力没有被显著影响。考虑到这三个基因是被母源给予的，作者们建立了母源突变体，三个母源突变体受精卵时期形态结构都是正常的，但是以1:1与野生型混合培养10周，母源突变体身体体积较短较小、生长迟缓。这些结果说明，QTRT1、QTGAL以及QTMAN对于斑马鱼中胚胎后生长非常关键。图2工作模型总的来说，作者们通过生物化学方法证明了tRNA反密码子中辫苷糖基化修饰的生物合成过程，并鉴定生物合成的酶QTGAL以及QTMAN。Q糖基化修饰在细胞中对于维持特定密码子翻译以及蛋白质稳定性非常关键。进一步地，作者们通过冷冻电镜解析了Q糖基化识别的分子基础。此外，作者们发现在脊椎动物模型斑马鱼中qtgal和qtman基因敲除系母源突变体会缩短动物体长，说明了Q糖基化对胚胎后生长的重要性。原文链接：?

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