文献解读丨胎盘来源的造血内皮细胞从头产生
年6月北京博奥晶典生物技术有限公司合作客户中国科学院动物研究所膜生物学国家重点实验室刘峰副主任、北京大学前沿交叉学科研究院教授韩敬东和中国科学院干细胞与再生研究所副院长王红梅合作在DevelopmentalCell（IF：12.）发表了胚胎造血组织研究的最新成果“Denovogenerationofmacrophagefromplacenta-derivedhemogenicendothelium”，至此，博奥晶典单细胞平台已累计支持客户发表文章44篇，累计影响因子达.分，是目前国内利用10x平台支持发文最多、累计影响因子最高的公司。
该研究使用多种单细胞检测技术，描绘了小鼠胎儿胎盘发育的单细胞图谱，并结合功能分析和细胞命运图谱等，解码小鼠胚胎胎盘造血的过程，同时鉴定了独特的胎盘生血内皮细胞（hemogenicendothelial，HE）细胞，并建立了一个新的Hoxa13CreER报告细胞系来追踪胎盘EC（EndothelialCells）及其衍生物，最后发现HBC-like（Hofbauercell）细胞来源于Hoxa13+ECs，促进血管生成和吞噬作用。本研究成果对解决HBC起源的争议问题提供了重要的信息。本研究中10xGenomics单细胞转录组测序由博奥晶典提供检测服务。
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解读作者的研究思路及主要结论科学问题
胎盘被证明在胚胎发育过程中可作为造血器官。一般认为，最终的造血细胞来源于拥有血液生成潜能的生血内皮细胞（hemogenicendothelial，HE）。而HE细胞根据其起源位点表现出不同的功能特性。然而，HE细胞是否存在于胎盘中，如果存在，其产生哪一种类型的血细胞等问题尚不清楚。
巨噬细胞是存在于不同器官的先天免疫细胞，已被证明其来源于卵黄囊初级巨噬细胞、EMP细胞（erythroid-myeloidprogenitor）和造血干细胞（hematopoieticstemcell，HSC）。在人类胎盘中，巨噬细胞也被称为霍夫鲍尔细胞（Hofbauercell，HBC），参与胎盘血管生成，并作为感染母亲的病毒进入胎盘的门户。然而，HBC的起源仍在争论中。考虑到小鼠模型中巨噬细胞的命运图谱已经说明了许多不同组织中巨噬细胞的起源，似乎可以采用类似的策略来解决HBC有争议的起源。
研究思路
研究结果
01
小鼠胎盘的单细胞转录组图谱
研究者利用EGFP+雄性与C57BL/6（EGFP-）雌性杂交的胎盘，消除了母体细胞的污染，其中胎儿源性细胞为GFP阳性。随后，对E10.0、E11.0和E12.0的GFP+胚胎细胞进行了scRNA测序，总共得到个细胞。根据细胞标志物，确定了五种主要的细胞类型。为了更详细地描述胎盘造血功能，造血细胞又被进一步分为9个不同的亚群，对应于6种细胞类型，包括了造血干细胞（HSPC），淋巴样祖细胞（lymphoidprogenitors，LymP），髓系祖细胞（myeloidprogenitors，MyeP），HBC-like细胞。此外，研究者发现造血细胞的比例发生了动态变化，表现为HSPC的比例从E10.0到E12.0不断增加。
图1小鼠胎盘的单细胞转录组图谱02
胎盘中具有造血潜能的CD44+ECs的鉴定
为了研究HE细胞是否存在于胎盘中所有胎盘，研究者将ECs进一步分为三个亚群，分别标注为EC1、EC2和EC3。其中EC1表现为毛细血管特征，EC2表现为动脉特征，EC3表现为静脉特征。结果表明，EC2可能是一种特化的动脉EC，与AGM来源的HE细胞具有相似的转录特征。为进一步探索EC2的造血潜能，研究者采用流式分选（FACS）方法捕获CD44+ECs细胞和CD44-ECs细胞，然后与OP9-DL1细胞共培养，发现CD44+ECs可分化为造血细胞，且功能研究表明，CD44+ECs（被称为HE细胞）可以在小鼠胎盘中生成造血细胞。此外，免疫荧光IF显示，CD44在妊娠9周后标记了人类胎盘ECs的一个子集与流式细胞结果一致。
图2胎盘中具有造血潜能的CD44+ECs的鉴定03
胎盘和AGM中的HE细胞比较
为了比较胎盘和AGM来源的HE细胞的分子特征，研究者利用CD44标记在E11.0时从AGM和胎盘中富集HE细胞和非HE细胞（CD44-ECs），进行Smart-seq2单细胞检测。基因表达谱显示，AGM和胎盘来源的HE细胞都表达了多个HE特异基因，以及高水平的内皮基因Cdh5和Pecam1。AGM和胎盘中HE和非HE细胞之间的差异分析和功能分析发现，炎症反应在HE细胞中富集，这与促炎信号可以指导HE细胞产生HSPCs的观点一致。而AGM和胎盘的HE比较分析则发现，与病毒过程相关的功能GO在胎盘HE细胞中富集，这与血液-胎盘屏障的存在相一致。同时，体外CFU-C实验发现胎盘来源的造血细胞比AGM来源的，具有更高的集落形成能力。
总之，尽管胎盘中的HE细胞与AGM细胞具有相似的转录特征，但在免疫和血液-胎盘屏障方面，它们表现出胎盘特异性特征并具有较高的造血能力。
图3胎盘和AGM中的HE细胞比较04
胎盘EC特异性Hoxa13转基因小鼠模型的建立
考虑到没有直接证据表明胎盘ECs是否能在体内产生造血细胞，研究者开始鉴定胎盘ECs中特异表达的基因。研究者使用卵黄囊中ECs用于Smart-seq2测序,最终将Hoxa13鉴定为胎盘特异性候选基因，类似的结果在10×转录组数据和IF分析中得到验证。同时，发现Hoxa13的表达仅限于尿囊组织，不能在E8.5的血液祖细胞、E9.5的EMPs和E10.0-E12.0的造血细胞中检测到。基于上述结果，研究者构建了一个他莫昔芬（TAM）-诱导小鼠模型（命名为Hoxa13CreER），并通过实验做了一系列的验证，表明Hoxa13在胎盘内皮细胞中表达，而Hoxa13CreER可用于标记胎盘内皮细胞。
图4胎盘EC特异性Hoxa13转基因小鼠模型的建立05
Hoxa13介导的命运图谱揭示了胎盘ECs中HBC-like细胞的从头生成
为了在转录组水平上鉴定Hoxa13表达细胞及其后代细胞类型，研究者对胎盘E11.0、E12.0和E13.5的Hoxa13谱系细胞进行了挑选，并进行Smart-seq2测序，最终鉴定了4种细胞类型，包括基质细胞、ECs、动脉ECs（AECs）和两群HBC-like细胞。Monocle2分析预测显示ECs逐渐向AECs分化，并最终产生HBC-like细胞，遵循体内内皮细胞到造血（EHT）的连续过程。同时，分子数据表明内皮程序的减少和造血程序的启动，且AEC亚群中已存在HE细胞。
研究者随后用FACS分选出GFP+HE细胞和GFP+非HE细胞与OP9细胞共培养，发现只有GFP+HE细胞产生了圆形细胞，同时流式结果也显示，一部分圆形细胞为CD45和CD68双阳性，暗示Hoxa13+EC来源的HE细胞可以产生HBC-like细胞。而流式和免疫荧光的结果都表明，胎盘来源的造血细胞只存在于胎盘中，不能在卵黄囊、AGM和胎肝中检测到。综上所述，这些结果表明，Hoxa13标记了一个能产生HBC-like细胞的胎盘HE细胞亚群。
图5Hoxa13介导的命运图谱揭示了胎盘ECs中HBC-like细胞的从头生成06
Hoxa13+EC来源的HBC-like细胞的两种亚型特征
为了区分Hoxa13+EC来源的两群HBC-like细胞，研究者通过了富集分析、候选标记marker、免疫荧光IF等方法，将CD45+CD68+CD74-的细胞定义为HBC-like-1，CD45+CD68+CD74+细胞定义为HBC-like-2。HBC-like细胞亚群的差异分析则发现，HBC-like-1主要富集于炎症反应、细胞因子、血管生成等功能，这与胎盘常被认为是哺乳动物妊娠中的炎症过程相一致。而HBC-like-2则富集于抗原加工呈递、吞噬作用等功能，与胎盘是妊娠期间母体组织和胎儿之间重要的组织屏障的观点一致。研究者使用CellPhoneDB软件分析预测HBC-like细胞与胎盘内其他细胞的相互作用，结果提示HBC-like-1可能在调节血管生成中发挥作用，同时Angpt2-Tie2信号与ECs的相互作用与免疫荧光实验也暗示HBC-like-1分泌的Angpt2可能在胎盘过程中发挥潜在作用血管生成。而其它结果则暗示HBC-like-2在吞噬过程中的发挥作用。最后，通过与人类胎盘单细胞公共数据的联合分析，发现HBC-like的两种亚型与人胎盘中的HBC亚群存在良好的进化保守性。图6Hoxa13+EC来源的HBC-like细胞的两种亚型特征
总结
研究者使用不同单细胞检测技术，描绘了一个小鼠胎儿胎盘发育的单细胞图谱，结合功能分析和细胞命运图谱，解码小鼠胚胎胎盘造血的过程，鉴定了独特的胎盘HE细胞，并建立了一个新的Hoxa13CreER报告细胞系来追踪胎盘EC及其衍生物，最后发现HBC-like细胞来源于Hoxa13+ECs，并进一步促进血管生成和吞噬作用。
局限
胎盘巨噬细胞是妊娠期间健康胎盘间质中唯一的胎儿免疫细胞群。明确其来源和功能对于深入了解胎儿胎盘免疫反应的发生具有重要意义。虽然本研究揭示了新的胎盘HE起源于胎盘巨噬细胞，但目前尚不清楚是否以及如何根据其签名识别和区分来自不同来源的巨噬细胞。为了解决这一重要的局限性，一旦巨噬细胞产生，标记它们的不同来源将是进一步研究的关键目标。此外，虽然本研究的结果预测了胎盘巨噬细胞潜在的生物学功能，但目前尚无实验证据表明其体内或体外功能，基于小鼠模型和细胞培养研究其功能将是探索的关键途径。
参考文献：LiangG,ZhouC,JiangX,etal.Denovogenerationofmacrophagefromplacenta-derivedhemogenicendothelium.DevelopmentalCell,.博奥晶典单细胞测序平台
博奥晶典作为国内第一家引进10xGenomics平台的公司，率先在国内开展上万级通量的单细胞转录组测序服务。目前已经完成了多例样品、几百种不同样品类型的服务，覆盖的物种和样品类型包括人和小鼠的肝脏、肺脏、皮肤、心脏、脑、肾脏、血液、卵巢、神经，以及鸡、斑马鱼、猪、水稻、拟南芥、油菜、白菜、橄榄等，是目前国内大规模单细胞测序经验极丰富的公司。博奥晶典于年12月同时获得了单细胞转录组，单细胞ATAC，单细胞免疫组库3个服务产品的官方CSP认证，并于年9月获得了空间转录组产品的官方CSP认证，成为目前国内唯一一家同时获得4项10xGenomics平台服务官方认证的公司。博奥晶典支持单细胞测序文章分别发表在Cell、CancerDiscovery、Circulation、CellStemCell、JournalofHepatology、CellResearch、NatureImmunology、NatureCellBiology、GUT、AdvancedScience等期刊，应用领域涉及细胞图谱绘制、类器官、生殖发育、干细胞、血管老化、血管异质性、肿瘤异质性、肿瘤免疫治疗、疾病机制研究等。至此，博奥晶典已累计支持客户发表单细胞高分文章44篇，影响因子.分，是目前国内支持发文最多、累计影响因子最高的公司。■博奥晶典目前可开展以下单细胞测序产品和服务：博奥晶典科研服务张议
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