CELL转录因子的协同作用网络对人类心脏
研究亮点：
1系统性方法揭示了GATA4在人类心脏发育和功能中的作用
2杂合子GATA4错义突变损害心脏基因程序
3GATA4GS突变破坏了心脏增强子TBX5的基因组占用
4PI3K信号通路是GATA4基因调控网络的关键枢纽
研究背景
转录因子(TFs)之间的组合相互作用导致组织特异性基因表达，从而决定了细胞的特性并维持细胞内稳态平。TFs通过招募其他TFs、辅激活因子或辅抑制因子来激活或抑制基因转录。超级增强子(SEs)，被中介复合物和TFs密集占据的假定增强子簇，被认为是发育和疾病中细胞同一性的调节因子。SEs的失调可能导致人类胚胎发生发育障碍和产后疾病。发育畸形占人类出生率大于5%。其中，先天性心脏缺损所占比例最高（0.8%），而且通常是由于发育性调节型心脏TFs单倍型不足而导致的。在TFs中杂合突变GATA4和TBX5会导致家族性先天性心脏发育不全，二者表型重叠；当过表达这两个基因时，两者免疫共定位。在零星的先天性心脏发育不全中，这两个基因存在突变，且与心肌病相关。我们之前的研究表明，GATA4在GS位点的突变会导致GATA4和TBX5在体外的互作能力受损。携带复合杂合子Gata4和Tbx5突变的小鼠会发生房室间隔缺损，为GATA4与TBX5二者之间的互作提供了遗传学证据。
尽管Gata4和Tbx5对小鼠心脏发生至关重要，但它们在人类心肌细胞（CMs）中共同调节的基因靶点或信号通路以及它们如何调节人类心脏间隔的形成尚不清楚。与GATA4相互作用的TBX5或Nkx2.5完全缺失，表明这些TFs在小鼠心脏分化中相互依赖调节彼此的基因组占用。
研究结果
转录因子中高度保守残基的突变可能会影响蛋白与蛋白或蛋白间的相互作用，导致基因网络的失调和人类疾病。本研究使用患者源性诱导多能干细胞(iPS)细胞来剖析GATA4在人类心脏发育和功能中的调节机制。研究人员利用了来自于患者GS突变的、通过CRISPR-Cas9修正的(iWT)以及正常人的野生型（WT）成纤维细胞以非整合游离载体方法重编程获得三种iPS，在图案化水凝胶的作用下将iPS培养分化为心肌细胞CMs。在分化CMs过程中，对其进行转录组测序及分析，对心肌细胞分化过程中的标志性基因表达情况，钙通量及显微镜下形态进行了检测和分析。
研究发现，杂合的GATA4GS突变损害了心脏基因程序和sonichedgehog(SHH)信号通路的表达，同时上调了可变命运基因的表达，特别是内皮细胞谱系和与心脏分隔相关的基因。在与心脏发育和肌肉收缩相关的基因SE元件处，GATA4依赖的TBX5的募集被中断，而在参与内皮分化的基因座染色质关闭失败。这项工作揭示了一个关键心脏TF的单一错义突变是如何通过剂量依赖性调节TF复合物向增强因子的招募而导致疾病的，并揭示了治疗干预的潜在节点。
图1GSCMs心脏功能受损。（A）流式分析来源于WT和GS分化而来的、乳酸纯化后的cTnT+CMs。（B）CMs的单细胞阵列的微图(上)和α-Actinin或F-actin的免疫染色(下)。（C）微观模式的收缩测量。WT和GS单厘米对1Hz起搏响应的百分比（左图）。牵引力显微镜测量力产生作为细胞运动的CMs对1Hz起搏响应的函数(右图)。（D）WT和GSCMs的动作电位测量。（E）微团簇上钙通量的测量。（F）特定微组织的钙通量测量。（G）α-Actinin染色观察单个肉瘤类CMs所占的百分比。（H）线粒体单厘米微模式染色强度(上图)。定量测量细胞核分裂追踪器相对于细胞面积的红色强度(下图)。（I）糖酵解功能测量。
图2GATA4-TBX5GRN显示枢纽集中于PI3K信号。（A）GATA4控制的GRN（B）按基因符号命名的前20个枢纽的子网络图（C）在PI3K信号被抑制(圆形)或激活(三角形)后iWT(黑色)和GS(红色)CMs产生的相对变化（D）PI3K信号被抑制(圆形)或激活(三角形)后，iWT(黑色)和GS(红色)CMs的搏动率测量（E）假设模型。上图，WT基因的心脏基因位点开放且允许G4T5与med1结合的SE元件结合，激活转录;G4T5和HDAC2抑制异常内皮基因转录。下图，GATA4GS的转录和表观遗传结果。心脏基因座降低了开放染色质和TBX5与SE元素的结合，降低了转录;异常开放的染色质缺失了GATA4-HDAC2，但TBX5富集，同时ETS因子的基序导致内皮基因转录沉默失败，其他参与间隔发育的位点未描述。
研究意义
本研究表明，适当的心脏发育和功能需要MED1结合的h3k27ac标记SE元素的GATA4-TBX5的共同参与，以维持开放的染色质状态并激活心源性基因转录。杂合性GATA4错义突变影响蛋白质-蛋白质相互作用，TBX5无法募集到SE元件与未能保持开放的染色质状态以及心脏基因的转录降低有关。GATA4GS突变允许TBX5和其他转录激活因子的错误定位，导致无法招募到HDAC2，并在内皮启动子上实现更封闭的染色质特征。结果导致内皮基因表达的异常激活和谱系改变。参与SHH信号接收和心脏分离的基因失调为GATA4GS患者的三维间隔缺损提供了分子基础。这些研究揭示了TF复合物如何通过协同调控反式作用因子的全基因组定位来控制基因表达的激活和抑制，以及当协同性被破坏时疾病是如何发生的。
这一研究结果解释了一个启动人类心脏基因程序的组合TF结合密码子，并揭示了通过错义突变破坏该密码子如何导致表观遗传和转录失调和人类疾病。ATAC-seq分析开放染色质特征和GATA4和TBX5结合位点的全基因组分析提供了人类TF结合增强子的详细目录，并补充了稀缺心脏细胞类型的编码数据，同时利用这些数据鉴定了一个假定的G4T5辅抑制子。综上所述，本研究揭示了一个组合的TF代码，这一代码确保了一个强大的心脏基因程序，阐明了当通过干扰该代码的TF协同性时人类疾病是如何发生的，并提出了治疗干预的潜在节点。
本实验中特别涉及了一种细胞培养和测量手段
iPS-CMs细胞的体外培养
将细胞接种在聚丙烯酰胺水凝胶装置上，该装置具有基质凝胶微结构。由缩印手段在水凝胶表面制备长宽比为7:1、面积为平方微米的矩形凹槽。这些特定的微结构具备一定的刚度及形状，有利于模拟体内CMs的真实环境，可原位培养并分析单个CMs。之后，可用牵引力显微镜计算细胞附着在聚丙烯酰胺表面所产生的力。
单个CMs收缩力测量
在水凝胶中混入荧光微珠，使用Zeiss倒置显微镜测试收缩CMs的明场视频以及因细胞收缩而移动的绿色荧光微珠的视频。明场视频被用来计算每个收缩周期的细胞运动及平均位移。荧光微珠视频则提交到牵引力显微镜算法来计算收缩力。
钙通量分析，膜片钳测试
Fluo-4染色后采用延时成像技术来测量钙通量。选择自发收缩的微团簇的特定区域，用软件量化动作电位之间测量到的钙瞬变表达相对于基线荧光的峰值振幅。采用全细胞膜片钳在单细胞水平测量CMs的动作电位
作为实验前置内容，细胞培养与力学、钙通量测试在后续基因表达分析工作中起到了关键性的作用。在该工作中使用的是英国Plexithermo的HCells高通量单细胞、器官功能测量及纳米水凝胶3D培养系统。
该系统可使用多种定制水凝胶耗材模拟细胞微环境，亦可以自行设计蚀刻水凝胶以满足不同的研究需求，尤其适用于心肌细胞体外培养环境的构建。搭配独特的细胞追踪技术，可短时间内测量个以上细胞的收缩及离子浓度变化情况。搭配多孔位细胞培养板，实现真正的高通量细胞测试，每个孔位即可作为一组对照实验，不同孔位同时培养，同时测量，极大节省时间及耗材。
适用范围：
1、心肌细胞
采用超速成像纳米水凝胶技术，可完美模拟器官硬度。批量测心肌细胞的力学指标和离子浓度变化。包括细胞收缩速度和力度、收缩功率，收缩角度，速度差和力差等，
2、细胞迁移和精子运动轨迹
跟踪检测细胞轨迹，并可计算定量数据，如：运动轨迹，距离和速度。
3、动态跟踪细胞增殖的情况，如菌落形成。
4、人iPS细胞衍生神经细胞的细胞活力测定：神经元运动的功率谱密度（PSD）可，用于准确预测细胞死亡。PSD表示一个单元在频域中的运动强度，能够更精确地预测细胞死亡。
5、核跟踪特征可用于分析癌细胞迁移
6、测量对象：癌细胞、斑马鱼、精子、菌落、贴壁细胞（如：急性分离的成年小鼠细胞，乳鼠细胞、成年大鼠的心肌细胞、骨骼肌细胞等）。
参考文献：
AngYS,RivasRN,RibeiroAJS,etal.DiseaseModelofGATA4MutationRevealsTranscriptionFactorCooperativityinHumanCardiogenesis[J].Cell,,(7):-.e22.
北京心动康达信息技术有限公司是一家专业经营实验室设备的公司。从成立以来陆续代理了Bio-Rad,Plexithermo等公司产品。公司依托这些品牌的良好技术和信誉，为用户提供全面、优质的实验室全套解决方案，不仅提供售前技术和快速供货服务，同时还提供包括安装调试、应用指导和维护保养在内的整套售后服务，持续稳定地为客户提供top的产品和优质的服务。公司以“致力于打造专业的技术支持团队，为用户提供top的实验室整体解决方案"为发展方向，以帮助用户“提升实验质量，创造大的效益"为努力目标，与客户携手并进，共同发展。
公司主要产品有高通量单细胞功能检测系统,细胞显微成像系统,多光谱数字连续切片扫描装置,激光多普勒脑血流监测仪,急性分离心肌细胞仪,离体心脏灌流系统,高低氧及特殊气体工作站,Syufe2r膜蛋白转运追踪系统,非标记细胞功能分析培养系统,心肌细胞功能分析仪。
更多关于以上设备的信息请咨询北京心动康达信息技术有限公司
官方网址：
转载请注明：http://www.abuoumao.com/hyfz/1698.html
